龍 麗， 劉冰妮， 劉 默， 儲德清， 祁浩飛， 王景陽， 劉登科

(1. 天津工業(yè)大學 環(huán)境與化學工程學院 中空纖維膜材料與膜工程國家重點實驗室，天津 300160；2. 天津藥物研究院 天津市新藥設(shè)計與發(fā)現(xiàn)重點實驗室，天津 300193)

吲唑衍生物由于其廣泛的藥理活性,在抗抑郁、抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等藥物[1]方面均有非常廣泛的應(yīng)用價值。英國Glaxo Smith Kline公司研發(fā)的第二代多靶點酪氨酸激酶抑制劑帕唑帕尼鹽酸鹽(Ⅰ)，化學名為5-【{4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基]嘧啶-2-基}氨基】-2-甲基苯磺酰胺鹽酸鹽，于2009年10月獲FDA批準并在美國上市，臨床用于治療晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌[2,3]。 Ⅰ通過選擇性抑制腫瘤細胞的VEGFR， PDGF和c-kit酪氨酸激酶起作用，效果顯著[4]。

CompabcdefAr O2SH2NOH- F- FOH- MeO- Cl- F3CO-CompghijkAr CO2Me- F- MeO2C- N- - N

Scheme1

本文以3-甲基-6-硝基-1H-吲唑(1)為原料，經(jīng)N-甲基化、催化還原、親核取代及烷基化反應(yīng)制得關(guān)鍵中間體N-(2′-氯嘧啶-4′-基)-N，2，3-三甲基-2H-吲唑-6-胺(5)； 5與芳胺(6a～6k)經(jīng)親核取代反應(yīng)合成了一系列新型的N-(2′-芳胺嘧啶-4′-基)-N，2，3-三甲基-2H-吲唑-6-胺衍生物(7a～7k， Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和EI-MS表征。用均相時間分辨熒光法(HTRF)測定了7a～7k對酪氨酸激酶VEGFR-2磷酸化的抑制作用。結(jié)果表明，7a～7k均對VEGFR-2有一定的抑制作用，其中7a和7i具有明顯的抗腫瘤活性。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

YRT-3型熔點儀；LabAlliance Series 1500型高效液相色譜儀(HPLC)；Bruker AV400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標)；ZAB-HS型高分辨核磁質(zhì)譜儀；HTRF KinEASE-TK kit型試劑盒；SpectraMax M5型酶標儀。

2～5參考文獻[5～9]方法合成。5：收率86%(83%[6])，m.p．172 ℃～173 ℃,純度99.2%(HPLC歸一化法，下同)；1H NMRδ: 2.62(s, 3H), 3.41(s, 3H), 4.05(s, 3H), 6.23(d,J=6.0 Hz, 1H), 6.87(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.49(s, 1H), 7.80(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.93(d,J=6.4 Hz, 1H)。柱層析用硅膠，200目～300目；其余所用試劑均為分析純。

1．2 合成

(1) 7a～7i的合成(以7a為例)

在三口瓶中依次加入5 2.86 g(100 mmol),無水乙醇50 mL和3-氨基-4-羥基苯磺酰胺(6a)1.89 g(100 mmol)，攪拌下于室溫緩慢滴加濃鹽酸1 mL，滴畢，回流反應(yīng)3 h(TLC跟蹤)。冷卻至室溫，過濾，濾餅干燥得白色固體7a。

用類似的方法合成白色固體7b～7i。

(2) 7j和7k的合成(以7j為例)

在三口瓶中依次加入5 3.6 g(12.6 mmol), 2-氨基-5-甲基吡啶(6j)1.62 g(15 mmol)及異丙醇30 mL，攪拌使其溶解。氮氣保護下快速加入叔丁醇鉀2.88 g,三(二芐亞基丙酮)二鈀[Pd2(dba)3]0.36 g(3% mol,以5計算)，2-二-叔丁膦基-2,4,6-三異丙基聯(lián)苯0.36 g(7% mol,以5計算),回流反應(yīng)3 h。過濾，濾液蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]純化得白色固體7j。

用類似的方法合成白色固體7k。

1．3 抗腫瘤活性測試

用HTRF法測定7a～7k對VEGFR-2磷酸化的抑制作用。設(shè)立3個對照試驗：陽性對照(帕唑帕尼)、空白對照和Cryptate對照；酶反應(yīng)體系：V(ATP) ∶V(TK Substrate-biotin) ∶V(Kinase buffer)=2 ∶2 ∶1；檢測體系：V(Streptavidin-XL665) ∶V(TK Antibody-Cryptate)=1 ∶1；在314 nm激發(fā)檢測665 nm和620 nm處熒光，計算其抑制率(表1)。

2 結(jié)果與討論

2．1 合成

在2，3-二甲基-6-氨基-2H-吲唑(3)的合成中，文獻[5]方法用氯化亞錫和濃鹽酸還原2，3-二甲基-6-硝基-2H-吲唑(2)。該方法后處理時乳化嚴重，產(chǎn)率較低，且產(chǎn)生大量廢水污染環(huán)境。本文改用Pd/C和甲酸銨還原體系，直接加入固體甲酸銨進行反應(yīng)，而非文獻[6,7]方法中加入其水溶液，有利于簡化后處理操作,反應(yīng)溫度由25 ℃[6]提高到55 ℃，反應(yīng)時間由6 h[6]縮短為1.5 h，優(yōu)化了投料比，n(2) ∶n(甲酸銨)=1 ∶3，收率與文獻[6]相當。

表1 7的實驗結(jié)果，MS數(shù)據(jù)和抗腫瘤活性Table 1 Experimental results， MS data and antitumor activities of 7

表2 7的1H NMR數(shù)據(jù)Table 2 1H NMR data of 7

續(xù)表2

Comp1H NMR δ(J/Hz)7j2.2(s, 3H), 2.62(s, 3H), 3.46(s, 3H), 4.05(s, 3H), 5.84(d, J=6.0, 1H), 6.87(d, J=12.8, 1H), 7.44(m, 2H), 7.75(d, J=8.8, 1H), 7.86(d, J=6.0, 1H), 8.05(s, 1H), 8.12(d, J=8.4, 1H), 8.88(s, 1H)7k2.36(s, 3H), 2.62(s, 3H), 3.47(s, 3H), 4.05(s, 3H), 5.85(d, J=6.0, 1H), 6.76(d, J=7.2, 1H), 6.88(d, J=8.8, 1H ), 7.45(m, 2H), 7.75(d, J=8.8, 1H), 7.87(d, J=6.0, 1H), 8.04(d, J=8.4, 1H), 8.82(s, 1H)

在N-(2-氯嘧啶-4-基)-2，3-二甲基-2H-吲唑-6-胺(4)的合成中，文獻[6]方法采用乙醇/四氫呋喃(4/1)混合溶劑反應(yīng)，本文改用無水乙醇作溶劑，簡化了實驗操作，且收率略高于文獻。

在7a～7i的合成中，反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物直接從反應(yīng)液中析出，過濾即得目標產(chǎn)物；而合成6j和6k時，采用上述方法則沒有化合物生成，可能是吡啶環(huán)上的N原子的電負性比C原子大，使得親核反應(yīng)很難進行。本文參考Buchwald-Hartwing偶聯(lián)方法[10,11]，在氮氣保護下，以異丙醇為溶劑，Pd2(dba)3為催化劑，2-二-叔丁膦基-2,4,6-三異丙基聯(lián)苯為配體，叔丁醇鉀為縛酸劑，反應(yīng)順利進行[12]。

2．2 實驗結(jié)果

7的實驗結(jié)果，MS數(shù)據(jù)和抗腫瘤活性見表1；1H NMR數(shù)據(jù)見表2。從表1可見，7a和7i的抑制率分別達67．6%和71．4%，顯示了較好的抗腫瘤活性。

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