張海娟，黃增榮，隆小華，劉 玲，劉兆普

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095

HPLC法測(cè)定不同品種不同產(chǎn)地菊芋葉片中綠原酸的含量

張海娟，黃增榮，隆小華，劉 玲，劉兆普*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095

為建立同時(shí)測(cè)定大豐地區(qū)3個(gè)菊芋品種及大慶地區(qū)2個(gè)菊芋品種葉片綠原酸含量的方法，采用高效液相色譜法對(duì)不同品種不同產(chǎn)地菊芋葉片中綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:1)在檢測(cè)條件流動(dòng)相為1%磷酸溶液、乙腈(87∶13)、流速1 mL/min和檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm時(shí)，綠原酸在0.01～0.1 mg/mL呈良好的線性關(guān)系，精密度良好，平均回收率為98.21%，RSD=0.68%;2)大豐地區(qū)南芋1號(hào)、青芋2號(hào)、南芋10號(hào)葉片中綠原酸含量分別為干重的0.431%、0.040%和0.933%;3)大慶地區(qū)南芋1號(hào)、南芋9號(hào)葉片中綠原酸含量分別為干重的1.245%、2.139%。研究結(jié)果表明菊芋葉片中綠原酸含量在不同品種不同生態(tài)區(qū)域間有差異，HPLC方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于菊芋葉片中綠原酸含量的測(cè)定。

高效液相色譜;菊芋;綠原酸;品種;產(chǎn)地

菊芋(Helianthus tuberosus Linn.)俗稱洋姜、地環(huán)、鬼子姜，原產(chǎn)于北美，為菊科(Compositae)向日葵屬多年生草本植物［1］。菊芋葉片中含有大量的化學(xué)成分，主要是酚類和倍半萜內(nèi)酯類化合物。綠原酸類化合物廣泛存在于植物中，是菊芋中的重要生理活性成分［2］，具有降壓、利膽、清除自由基、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等功能，此外還能抗過敏、抗艾滋病毒、預(yù)防心血管疾病和糖尿病等功能［3］［4］。綠原酸(Chlorogenic acid)，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，為多酚類化合物，是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid)組成的縮酚酸，異名咖啡單寧酸，化學(xué)名3-O-咖啡?？崴?3-O-caffeoylquinic acid)，分子式:C16H18O9，分子量:345.30。綠原酸主要存在于金銀花和杜仲中［5，6］。

近年來對(duì)綠原酸的研究主要集中于金銀花和杜仲葉中綠原酸的提取純化、含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)鑒定及藥理作用等方面［7］。菊科向日葵屬植物菊芋中富含綠原酸類化合物［2］。本文探索采用HPLC檢測(cè)方法檢測(cè)菊芋葉片中綠原酸條件，并對(duì)大豐地區(qū)3個(gè)菊芋品種葉片及大慶地區(qū)2個(gè)菊芋品種葉片綠原酸的含量進(jìn)行比較，以期為菊芋葉片中綠原酸的測(cè)定及提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，Agilent化學(xué)工作站(美國(guó)安捷倫公司);超聲波清洗器(KH2200，昆山禾創(chuàng));萬(wàn)分之一電子分析天平;烘箱;微型粉碎機(jī)(FZ102，天津泰斯特)。

1.2 試劑

綠原酸對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢測(cè)所;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.3 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料共計(jì)5份(表1)，分別于2009年9月采于大豐試驗(yàn)基地，2009年8月采于大慶試驗(yàn)基地，洗凈后低溫烘干，備用。

表1 菊芋葉片品種及產(chǎn)地Table 1 Varieties and producing area of the leaves of H.tuberosus

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent C18(4.6×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:1%磷酸溶液∶乙腈=87∶13，流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):327 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.5 對(duì)照品溶液制備

用萬(wàn)分之一天平精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用60%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶，搖勻，作為原液。再分別稀釋到0.06、0.04、0.02 mg/mL和0.01 mg/mL，用60%乙醇定容于50 mL容量瓶，搖勻待用。

1.6 樣品測(cè)定溶液的制備

各樣品分別取菊芋葉片烘干、粉碎，過40目篩。精密稱取粉碎的菊芋葉片1 g(3份)，加入20 mL甲醇，超聲提取2次，每次45 min，合并濾液，定容至50 mL。將提取液過0.45 μm濾膜，作為樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系的考察

精密吸取對(duì)照品溶液5 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，見圖1。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，樣品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明綠原酸在0.01～0.1 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為Y=m*X+b，m =20156.59087，b=﹣6.61778，相關(guān)性:0.99998。

圖1 綠原酸對(duì)照品(A)和菊芋葉樣品(B)HPLC圖譜Fig.1 The HPLC Chromatogram of chlorogenic acid standard (A)and sample of H.tuberosus leaves(B)

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液5 μL注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積，RSD為0.155%，精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 綠原酸含量測(cè)定的精密度實(shí)驗(yàn)Table 2 Precision experiment of chlorogenic acid content determination

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液，每隔2 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，結(jié)果表明在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精確稱取同一樣品5份，依2.3方法制備樣品溶液，分別在相同條件下測(cè)定綠原酸的含量，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表3 綠原酸回收率Table 3 Recovery of chlorogenic acid

在樣品中加入一定濃度的綠原酸對(duì)照品溶液，按“樣品測(cè)定溶液的制備”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3，綠原酸的平均回收率為98.65%，RSD=0.68%。

2.6 樣品含量的測(cè)定

分別稱取大豐地區(qū)3個(gè)菊芋品種葉片粉末及大慶地區(qū)2個(gè)菊芋品種葉片粉末，按“1.6”的方法制備供試液，測(cè)定含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地不同品種菊芋葉片綠原酸含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Content of chlorogenic acid from different artichoke varieties in different producing area

對(duì)大豐地區(qū)菊芋葉片綠原酸含量的測(cè)定，菊芋10號(hào)葉片的含量達(dá)到干重的0.933%，明顯高于南芋1號(hào)的0.431%和青芋2號(hào)的0.040%，差異較大，表明大豐地區(qū)不同品種菊芋葉片綠原酸含量有較大差異。由于青芋2號(hào)成熟較早，采樣時(shí)部分已經(jīng)枯萎，所以含量不高，有待來年采樣繼續(xù)研究。對(duì)大慶地區(qū)菊芋葉片綠原酸含量的測(cè)定，南芋1號(hào)葉片的含量達(dá)到干重的2.139%，高于菊芋9號(hào)的1.245%，大慶地區(qū)2個(gè)品種菊芋葉片綠原酸含量也有較大差異。采自大慶基地的樣品中綠原酸含量明顯高于大豐地區(qū)，可能與當(dāng)?shù)貧夂?、光照、水分等因素有關(guān)。

3 結(jié)論

3.1 在選擇流動(dòng)相時(shí)，比較了甲醇-水-磷酸和乙腈-水-磷酸系統(tǒng)，以甲醇-水-磷酸為流動(dòng)相時(shí)，樣品的保留時(shí)間較長(zhǎng)，且分離度不是很好。而以乙腈-水-磷酸為流動(dòng)相時(shí)，綠原酸與雜質(zhì)能得到較好的分離，加酸后能夠抑制拖尾現(xiàn)象。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種及不同產(chǎn)地菊芋葉片的主要活性成分-綠原酸含量的分布范圍是0.040%～2.139%，差異較大。

3.3 試驗(yàn)表明菊芋葉片中綠原酸含量在不同品種不同生態(tài)區(qū)域間有差異，可根據(jù)菊芋不同用途選擇不同菊芋品種在不同區(qū)域進(jìn)行種植。

1 Stanley JK，Stephen FN.Biology and Chemistry of Jerusalem Artichoke.New York:CRC Press，2008.55.

2Yuan XY(袁曉艷)，Gao MZ(高明哲)，Wang K(王鍇)，et al.Analysis of chlorogenic acids in Helianthus tuberosus Linn leaves using high performance liquid chromatography-mass spectrometry.Chin J Chrom(色譜)，2008，26:335-338.

3 Chen JJ(陳娟娟)，F(xiàn)ang JG(方建國(guó))，Wan J(萬(wàn)進(jìn))，et al.An in vitro study of the anti-cytom egalovirus effect of chlorogenic acid.Herald Med(醫(yī)藥導(dǎo)報(bào))，2009，28:1138-1141.

4 Liu JH(劉軍海)，Qiu AY(裘愛泳)，Ren HL(任惠蘭).Research on extraction and purification progress of chlorogenic acid in Flos Lonicerae.J Tradit Chin Veter Med(中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志)，2007，6:32-35.

5 Wang LN(王麗楠)，Yang MH(楊美華).Comparison of the content of main effective constituents among different parts of Eucommiae ulmoides.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2009，21:108-110.

6 Liu JH(劉軍海)，Qiu AY(裘愛泳).The extraction and purification of chlorogenic acid from leaves of Eucommia ulmoides.Shandong Med J(山東醫(yī)藥)，2004，44(32):7-9.

7 Li LJ(李利軍)，Hao XC(郝學(xué)超)，Cheng H(程昊)，et al.Simultaneous determination of chlorogenic acid and cafeic acid by sweeping miceilar electrokinectic capmary chromatography.Chin J Anal Lab(分析實(shí)驗(yàn)室)，2008，28:119-122.

Determination of Chlorogenic Acid of Different Varieties of Helianthus tuberosus Leaves from Different Areas by HPLC

ZHANG Hai-juan，HUANG Zeng-rong，LONG Xiao-hua，LIU Ling，LIU Zhao-pu*
Jiang Su Provincial Key Laboratory of Marine Biology，College of Resources and Environmental Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

The aim of this study is to develop a method for determining the content of chlorogenic acid in 3 varieties of Helianthus tuberosus in Dafeng area and 2 varieties of Helianthus tuberosus in Daqing area.Accordingly，HPLC technology was used to determine the chlorogenic acid content in the leaves of the Helianthus tuberosus in different varieties from different areas.The results showed:1)The calibration curve showed a good linear relationship in the range of 0.01-0.1 mg/mL for chlorogenic acid under the conditions of 1%water-phosphoric-ACE(87∶13)as the mobile phase，a flow rate of 1.0 mL/min and detection wavelength of 327 nm.The precision was fine，and the average recovery rate of chorogenic acid was 98.21%，RSD was 0.68%.2)In Dafeng area，the chlorogenic acid contents in the leaves of the dry weight of Nanyu No.1，Qingyu No.2，Nanyu No.10 were 0.431%，0.040%，0.933%.3)In Daqing area，the chlorogenic acid contents in the leaves of the dry weight of Nanyu No.1，Nanyu No.9 were 1.245%，2.139%.These results suggested that chlorogenic acid content in Helianthus tuberosus leaves was dependent on the variety differences and ecological region differences.This method of HPLC is simple，rapid and accurate and thus is suitable for measuring the chlorogenic acid content in Helianthus tuberosus leaves.

HPLC;Helianthus tuberosus;Chlorogenic acid;variety;experimental place

1001-6880(2011)06-1107-04

2010-04-26 接受日期:2010-07-30

國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2007AA091702);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(200903001-05)

*通訊作者 E-mail:sea@njau.edu.cn

Q949.783.5

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