張國(guó)偉，李彩霞，王艷峰，黃 羽，蘇芝軍，鄭 芳，曾 星*

1河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，保定071002;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006; 3中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫(yī)院，府谷719400

高效液相法與硫酸-蒽酮法測(cè)定豬苓多糖含量比較

張國(guó)偉1，李彩霞2，王艷峰3，黃 羽2，蘇芝軍4，鄭 芳2，曾 星2*

1河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，保定071002;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006;3中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫(yī)院，府谷719400

本研究目的是比較高效液相法與硫酸-蒽酮法在測(cè)定豬苓多糖含量上的差異。為此，研究采用水提醇沉、Sevag法除蛋白、透析和冷凍干燥制備相對(duì)純化的豬苓多糖，通過(guò)凝膠滲透色譜及高效液相法對(duì)豬苓多糖的相對(duì)分子量分布、組成及含量進(jìn)行研究，用硫酸-蒽酮分光光度法測(cè)定豬苓顆粒中豬苓多糖的含量。結(jié)果顯示，豬苓多糖數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為48，232，重均相對(duì)分子質(zhì)量為117，506，分子范圍2.44，可能由海藻糖和葡萄糖組成，其含量分別為6.05%和62.28%。硫酸-蒽酮法側(cè)的豬苓多糖含量為87.9%。對(duì)于豬苓多糖含量測(cè)定，高效液相法優(yōu)于硫酸-蒽酮法。

豬苓多糖;高效液相法;硫酸-蒽酮法

藥用豬苓為多孔菌科多孔菌屬真菌豬苓(Polyporus Umbellatus(Pers.)Fries)的干燥菌核，為利水滲濕常用中藥。豬苓多糖(PPS，polyporus polysaccharide，水溶性多聚糖聚6-支鏈β-1，3-葡聚糖)為豬苓中主要成分，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［1］，是一種極有潛力的免疫增強(qiáng)劑［2］。前期研究證實(shí)PPS對(duì)膀胱癌細(xì)胞有抑制作用，體外應(yīng)用于小鼠膀胱癌細(xì)胞T739，可通過(guò)降低IKBKB基因表達(dá)激活Toll信號(hào)通路相關(guān)基因抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖［3，4］。本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法制備豬苓粗多糖，通過(guò)Sevag法除蛋白后再次醇沉并通過(guò)透析和冷凍干燥制備相對(duì)純化的豬苓多糖，通過(guò)凝膠滲透色譜(GPC，gel permeation chromatography)及HPLC法測(cè)定其相對(duì)分子量分布、組成及含量。為簡(jiǎn)化豬苓多糖的測(cè)量方法，實(shí)驗(yàn)中還使用硫酸-蒽酮分光光度法測(cè)豬苓顆粒中豬苓多糖的含量，并與HPLC法測(cè)定結(jié)果比較研究，探討了有關(guān)實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

1 材料、試劑與儀器

豬苓顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)，0811174)，葡萄糖，棉籽糖，海藻糖(sigma)，蒽酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(Merck公司，HPLC級(jí))，實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水，其它試劑均為分析純。

UV-2650紫外分光光度計(jì)(日本島津)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV 10basic V，德國(guó)IKA公司)，冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9146A型，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，分析天平(AL104-LC，METTER TOLEDO公司)，超低溫冰箱(U725，美國(guó)NBS公司)，離心機(jī)(LD25-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Agilent 1100高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 豬苓多糖的提取

豬苓顆粒(0.5 g/10 g生藥)100 g，溶于2000 mL水中，100℃水浴1.5 h，抽濾，濾渣再重復(fù)提取1次，合并2次濾液，紗布過(guò)濾，3000 r/min離心10 mim，上清減壓濃縮至合適體積，加95%乙醇，使其濃度達(dá)到80%，攪拌，置4℃箱中過(guò)夜，離心分離收集沉淀得粗多糖，抽濾液減壓濃縮。將所得粗多糖冷凍干燥，粗多糖溶于純水中，Sevage法(氯仿:正丁醇=5∶1，先加入氯仿，調(diào)pH=4-5，隨后加入正丁醇)，混合物劇烈震蕩20 min，蛋白質(zhì)變性成膠狀，存在于水相和溶劑相的交界面上，3000 r/min離心10 mim，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白，重復(fù)5次。將溶液減壓濃縮后加入95%乙醇使溶液中使醇濃度為80%，置4℃箱中過(guò)夜，3000 r/min離心10 mim，冷凍干燥，得除蛋白多糖。將所得除蛋白多糖溶于純水，緩慢溶解，用玻棒攪拌，使不溶物緩慢溶解，記錄溶液體積。用3%稀氨水調(diào)節(jié)溶液PH值為8～9，將多糖粗品水溶液加入500 mL三頸燒瓶，向燒瓶中加入1/3體積的30%H2O2，在50℃條件下攪拌2.5 h，溶液顏色逐漸變淺，待溶液冷卻，加入95%乙醇使溶液中醇濃度為80%，置4℃箱中過(guò)夜，離心收集沉淀，將沉淀溶于適量純水中，用流水透析48 h，純水24 h(每6 h換水一次)，透析后溶液加95%乙醇使醇濃度為80%，置4℃箱中過(guò)夜，離心收集沉淀，沉淀冷凍干燥，得豬苓多糖。

2.2 GPC法測(cè)定豬苓多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布

2.2.1 GPC條件

色譜柱，TSK-GEL G3000SWXL，300 mm×7.8 mm，柱溫35℃;流動(dòng)相，0.05 M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=6.7，加0.05%NaN3);體積流量，0.5 mL/min;示差折光檢測(cè)器，恒溫35℃;進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 GPC校正曲線的建立

取已知相對(duì)分子質(zhì)量為738、5800、1.22×104，4.8×104，1.0×105，1.86×105，3.8×105，8.35× 105的多糖標(biāo)樣，用0.05 M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(PH=6.7，加0.05%NaN3)溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，進(jìn)行GPC分析。以多糖標(biāo)樣的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，多糖相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)做GPC普適校正曲線。

2.2.3 樣品分析

取一定量豬苓多糖樣品，用0.05 M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=6.7，加0.05%NaN3)溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，進(jìn)行GPC分析。根據(jù)樣品出峰時(shí)間在校正曲線上求得多糖峰的平均相對(duì)分子質(zhì)量及分布。

2.3 HPLC法測(cè)定豬苓多糖組成及其含量

2.3.1 豬苓多糖的水解

取200 mg純化豬苓多糖，加入2 M H2SO438 mL加熱回流6h，冷卻，用飽和Ba(OH)2溶液中和至中性，過(guò)濾，清液濃縮定容至10 mL，進(jìn)行HPLC分析。

2.3.2 HPLC條件

色譜柱為Kromasil NH2(250 mm×4.6 mm)，柱溫45℃;流動(dòng)相:乙腈-水(80∶20);體積流量:1.2 mL/min;示差折光檢測(cè)器，恒溫45℃;進(jìn)樣體積10 μL。

2.4 硫酸-蒽酮法測(cè)定豬苓多糖含量

2.4.1 蒽酮試劑

溶解0.2 g蒽酮于濃硫酸中(A.R.)，當(dāng)日配制使用。

2.4.2 測(cè)試條件的選擇

將精密稱取干燥至恒重的葡萄糖50.0 mg置于50 mL量瓶中，純水溶解并定容至刻度，搖勻，制得1.0 g/L葡萄糖貯備液。取葡萄糖貯備液以純化水稀釋成200 mg/L制得葡萄糖稀釋液。吸取葡萄糖稀釋液2.0 mL，置于具塞試管中，加入2 g/L蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，后放入熱水浴中，管口加蓋玻璃塞，以防蒸發(fā)，準(zhǔn)確煮沸10 min取出，自來(lái)水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。將精密稱量干燥至恒重的豬苓多糖樣品0.5 g，加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，精密移取25.0 mL于500 mL量瓶中，加水定容，得豬苓多糖貯備液。取2.0 mL豬苓多糖貯備液，置于10 mL具塞試管中，按上法操作，在460 nm～800 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描［5］。

2.4.3 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取葡萄糖貯備液1，2，3，5，8，10 mL，分別置于50 mL量瓶中，加水至刻度(相當(dāng)于20，40，60，80，100，160，200 mg/L)。分別取上述溶液2.00 mL置10 mL具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起放入熱水浴中，管口加蓋玻璃塞，以防蒸發(fā)，準(zhǔn)確煮沸10 min取出，自來(lái)水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，在610 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。得到每1 mL含葡萄糖20～200 μg范圍內(nèi)葡萄糖量和吸收度呈良好的線性關(guān)系，求回歸方程。

2.4.4 精密度試驗(yàn)

平行取7份葡萄糖稀釋液和豬苓多糖供試液，蒽酮-硫酸法顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取葡萄糖稀釋液和豬苓多糖的供試液，置于具塞試管中，各加入加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，于室溫自然光下放置2 h，每10 min測(cè)定一次，求A值在120 min內(nèi)穩(wěn)定性。

2.4.6 重復(fù)性考察

取同一批樣品，按粗多糖貯備液的制備方法平行制備6份，按上述方法進(jìn)行含量測(cè)定，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算濃度，考察重復(fù)性。

2.4.7 回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取5.0 mg葡萄糖，配制成50 mg/L溶液。向50 mL量瓶中分別精密量取5 mL豬苓多糖貯備液5份，同時(shí)，分別精密加入1.0 mL葡萄糖溶液，后用純化水稀釋至50 mL。按“2.4.2”項(xiàng)下操作進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率?；厥章使?(最終測(cè)得量-原樣品已知量)/對(duì)照品加入量×100%。

2.4.8 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確移取豬苓多糖供試液1.0 mL，按“2.4.3”方法顯色，測(cè)定吸光度，以下列公式計(jì)算各樣品多糖的含量(mg/g):多糖的含量=(C×D)/(w×E)式中:C為測(cè)試液中多糖濃度(g/L)，D為供試液的稀釋因子，E為稱量多糖樣品占提取總多糖樣品比例因子，w為樣品質(zhì)量(g)。

3 結(jié)果

3.1 豬苓多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布

豬苓多糖數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為48232，重均相對(duì)分子質(zhì)量為117506，分子范圍為2.44［圖1］。

圖1 豬苓多糖GPC色譜圖Fig.1 The GPC chromatogram of polyporus polysaccharide from Polyporus Umbellatus(Pers.)Fries.

3.2 豬苓多糖組成及含量

豬苓多糖水解后用HPLC分析其單糖組成，并與單糖標(biāo)樣進(jìn)行對(duì)照，豬苓多糖可能由海藻糖和葡萄糖組成，其含量分別為6.05%和62.28%［圖2］。

圖2 A葡萄糖HPLC色譜圖;B海藻糖HPLC色譜圖;C豬苓多糖HPLC色譜圖Fig. A.The HPLC chromatogram of glucose;B.The HPLC chromatogram of trehalose;C.The HPLC Chromatogram of polyporus polysaccharide

3.3 硫酸-蒽酮法測(cè)定豬苓多糖含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.0039x-0.0163，R2= 0.9987;葡萄糖與豬苓多糖的精密度RSD分別為2.94%和3.03%;120 min內(nèi)，葡萄糖和豬苓多糖穩(wěn)定性RSD值分別為1.1%和0.76%，按此方法顯色得到的結(jié)果是穩(wěn)定的，本實(shí)驗(yàn)選擇室溫放置時(shí)間為10 min;豬苓多糖貯備液的平均質(zhì)量濃度重復(fù)性RSD為1.91%;豬苓多糖回收率為98.6%;豬苓多糖含量為879 mg/g。

4 討論

驗(yàn)用水提醇沉法制備豬苓粗多糖，采用Sevage法除蛋白后再次醇沉以及透析和冷凍干燥的方法對(duì)所提取的豬苓粗多糖進(jìn)行純化。粗多糖提取物中含有大分子蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合，形成蛋白多糖，但大部分蛋白質(zhì)是以游離狀態(tài)存在于多糖粗提物中的，因而脫蛋白是分離多糖的重要步驟。粗多糖中還含有比較多的色素物質(zhì)(游離色素或結(jié)合色素)，色素的存在會(huì)污染后續(xù)處理實(shí)驗(yàn)，也會(huì)影響多糖的外觀色澤，因而必須除掉。實(shí)驗(yàn)中，冷凍干燥步驟較為關(guān)鍵，能使多糖在低溫(-70℃)和減壓狀態(tài)下迅速干燥，避免了糖苷鍵的斷裂。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍干燥后的多糖溶解性明顯強(qiáng)于經(jīng)直接干燥的多糖。這是由于緩慢干燥時(shí)，存在于多糖分子周圍的水分子逐漸被抽除，多糖體分子間借次價(jià)力而緊密結(jié)合，使表觀分子量顯著增加，從而溶解性能降低。

凝膠滲透色譜法根據(jù)大分子化合物的體積及相對(duì)分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離，可以不破壞大分子化合物的原有結(jié)構(gòu)和性質(zhì)直接進(jìn)行分析，因此適合分析多糖。在凝膠滲透色譜中相對(duì)分子質(zhì)量大的先出峰，相對(duì)分子質(zhì)量小的后出峰，凝膠色譜圖的每個(gè)峰都反映了大分子化合物的相對(duì)分子質(zhì)量分布，通過(guò)已知相對(duì)分子質(zhì)量的多糖標(biāo)樣所作的普適校正曲線求得相對(duì)分子質(zhì)量。多糖的分子量分布形態(tài)受聚合方式和聚合因素的影響而有所不同，可用表示多分散程度的參數(shù)，如分布寬度指數(shù)表示，分布寬度越大，多糖分子大小差別就越大，分散程度就越明顯［6］。多糖是由一個(gè)個(gè)單糖基連接而成的天然大分子化合物，用高效液相色譜法分析多糖，需要將多糖水解成單糖后進(jìn)行，用來(lái)分析多糖組成情況及個(gè)組成單糖含量。

蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量，是利用多糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成羥甲基糠醛，羥甲基糠醛與蒽酮綜合成藍(lán)色化合物，比色該化合物顏色的深淺來(lái)計(jì)算多糖濃度的高低。加入蒽酮試劑時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量，反應(yīng)溫度和時(shí)間條件不易控制。置于冰水浴中冷卻，再平行加熱相同時(shí)間后冷卻，可以較好的提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。在該條件下顯色產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為610 nm。在多糖的含量測(cè)定中，因?yàn)槎嗵墙M成復(fù)雜而難以得到相應(yīng)的多糖對(duì)照品，所以多采用葡萄糖代替對(duì)照品，但這只能測(cè)得樣品中多糖的相對(duì)含量，樣品中多糖的準(zhǔn)確含量必須通過(guò)單糖和多糖之間的換算因子計(jì)算來(lái)獲得。實(shí)驗(yàn)中提取物中有游離的單糖，影響測(cè)定結(jié)果，采用乙醇沉淀后進(jìn)行測(cè)定，避免單糖和小分子寡糖對(duì)多糖含量測(cè)定的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，豬苓多糖可能由海藻糖和葡萄糖聚合而成，其中葡萄糖占其中絕大部分，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為48232，重均相對(duì)分子質(zhì)量為117506，分子范圍為2.44。

由HPLC法測(cè)得多糖純度為68.33%，由蒽酮-硫酸法側(cè)的多糖純度為87.9%，蒽酮-硫酸法所測(cè)多糖含量明顯高于HPLC所測(cè)含量，原因可能是蒽酮-硫酸法測(cè)得的是總糖含量，且硫酸-蒽酮法操作精密度差。故可得出結(jié)論，測(cè)定多糖含量方面，HPLC法優(yōu)于硫酸-蒽酮法。

1 Nie H(聶紅)，Ma AL(馬安倫)，Shen BH(沈佰華)，et al.Immunoregulation effect of compound Polyporus umbellatus polysaccharide on mice.Chin J Cell Mol Immunol(細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志)，2000，16:384-386.

2 Zhang JC(張俊才)，Jian ZJ(簡(jiǎn)子健)，Deng PH(鄧普輝)，et al.Effect of different adjuvants to immunity of BCG.Prog Veter Med(動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展)，2003，24(5):96-98.

3 Wei JA(危建安)，Zeng X(曾星)，Han L(韓凌)，et al.Expression of Toll signal pathway-associated genes in bladder cancer cell line stimulated by polyporus polysaccharide.Immunol J(免疫學(xué)雜志)，2009，25:375-379.

4 Wei JA(危建安)，Zeng X(曾星)，Han L(韓凌)，et al.Effect of NF-κB p65 activity through Toll-like receptors in mice bladder cancer cell line T739 induced by Bacillus Calmette-Guerin.Chin J Cell Mol Immunol(細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志)，2009，25:276-279.

5 Zhang WJ(張惟杰).Glycoconjugates biochemical research technology(糖復(fù)合物生化研究技術(shù))，2ndEd.Hangzhou: Zhejiang University Press，1999.12-13.

6 Yu SL(于世林).The HPLC methods its application(高效液相色譜方法及應(yīng)用)，1stEd.Beijing:Chemical Industry Press，1999.159.

Determination and Comparison of Polyporus Polysaccharide by HPLC and Anthrone-Sulfuric Acid Method

ZHANG Guo-wei1，LI Cai-xia2，WANG Yan-feng3，HUANG Yu2，SU Zhi-jun4，ZHENG Fang2，ZENG Xing2*1College of Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071002，China;2Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;3Sinopharm ChuanKong pharmaceutical CO.，LTD，Chengdu 610051，China;4Fugu Peoples Hospital of Shanxi，F(xiàn)ugu 719400，China

This method is aimed to compare the differences between HPLC and anthrone-sulfuric acid method in determining Polyporus Polysaccharide(PPS).PPS was prepared by water extracting-alcohol precipitating，deproteinization with Sevag method，dialysis and freeze-drying.Relative molecular weight of PPS was determined by Gel Permeation in Chromatography(GPC)and the constitutes were analyzed by HPLC.At the same time，anthrone-sulfuric acid method was used to measure the content and purity of PPS.The results showed that the number-average molecular weight(Mn)of PPS wass 48，232，weight-average molecular weight(Mw)was 117，506，the polydispersity(Mw/Mn)was 2.44.PPS was composed of glucose(62.28%)and trehalose(6.05%).The PPS purify degree was 87.9%by anthrone-sulfuric acid method.Conclusively，HPLC method was superior to anthrone-sulfuric acid method in determining of PPS content.

Polyporus polysaccharide;HPLC;anthrone-sulfuric acid method

1001-6880(2011)06-1099-04

2010-08-24 接受日期:2010-12-13

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B030700059);河北大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(2010Q46);河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(20110514)

*通訊作者 Tel:86-20-39318678;E-mail:zengxing-china@163.com

R284.2

A