孫希云，劉 寧，孟憲軍*，李 斌，張 琦

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院;2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽110161

藍(lán)莓多糖BBP3-1的分離及結(jié)構(gòu)分析

孫希云1，劉 寧2，孟憲軍1*，李 斌1，張 琦1

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院;2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽110161

采用酶法優(yōu)化進(jìn)行水提醇沉得到藍(lán)莓粗多糖。經(jīng)雙氧水脫色、酶解和三氯乙酸正丁醇結(jié)合法脫蛋白后通過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和sephacryl s-300 HR凝膠過濾層析得到藍(lán)莓多糖(BBP3-1)。經(jīng)紫外掃描顯示無蛋白、核酸雜質(zhì)。經(jīng)高效液相色譜分析，BBP3-1的重均分子量Mw為18643 Da，數(shù)均分子量Mn為9658 Da，峰位分子量Mp為3554 Da，分子量分布寬度(Mw/Mn)為3.186。氣相色譜分析確定單糖組成為:鼠李糖、半乳糖和葡萄糖，其摩爾比為1∶1.5∶2。經(jīng)紅外色譜和核磁共振分析，可推測多糖BBP3-1是以1，6連接的吡喃葡萄糖鏈為主鏈，含有鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和糖醛酸，不含甘露糖的β構(gòu)型酸性多糖。

藍(lán)莓;多糖;分離;結(jié)構(gòu)

藍(lán)莓(Blueberry)，學(xué)名越桔，為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠果樹，呈灌木。該屬植物在全世界有450種，中國已知有91種，南北方均有野生資源分布，但主要分布在西南、華南及東北地區(qū)［1］。近年來，加拿大、日本和歐洲的很多國家都把藍(lán)莓視為保健與功能食品，倍受人們青睞。在英國權(quán)威營養(yǎng)學(xué)家列出的全球l5種健康食品中藍(lán)莓食品居首位，在聯(lián)合國糧農(nóng)組織列出的人類五大健康食品中藍(lán)莓食品是其中之一。因此，20世紀(jì)后期，藍(lán)莓(blueberry)正是以其獨(dú)特的保健營養(yǎng)價(jià)值在國外市場上引起廣泛的重視和應(yīng)用，成為目前熱門的開發(fā)產(chǎn)品之一。我國對(duì)于藍(lán)莓的研究目前還主要集中在引種栽培和產(chǎn)品的初加工方面［1，2］。

近幾十年來，人們發(fā)現(xiàn)從植物中提取的多糖具有非常重要與特殊的生理活性，具有抗腫瘤和免疫促進(jìn)，抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老等作用。目前國內(nèi)外對(duì)于漿果類果實(shí)中活性多糖構(gòu)效關(guān)系方面的研究還相對(duì)還較少［3］，特別是對(duì)于藍(lán)莓果中多糖結(jié)構(gòu)及功能性方面的研究還未見報(bào)道。本文對(duì)藍(lán)莓中多糖的分離、結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步研究其生理活性和產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為漿果類資源的綜合開發(fā)利用提供了新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

藍(lán)莓，購于遼寧藍(lán)金實(shí)業(yè)有限公司，品種為北藍(lán);果膠酶(分析純)，木瓜蛋白酶(分析純)，為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DEAE-52纖維素，購于Whatman公司;Sephacryl S-300，購于GE Healthcare公司;牛血清蛋白(生化試劑)，購于北京奧博星生物試劑公司;考馬斯亮藍(lán)G-250(Fluka)購于上?；瘜W(xué)試劑公司;藍(lán)色葡聚糖，葡聚糖-90，葡聚糖-70，葡聚糖-40，葡聚糖-10，色譜級(jí)，購于瑞典PHarmacia公司;透析袋(分子截流量為14000 Dal，美國);化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-1100紫外可見分光光度計(jì)，上海分析儀器廠;高效液相色譜儀，RID-10A視差折射鑒定器，CLASS-Vp(軟件)工作站，均為日本Shimadzu公司; Tensor 27傅立葉紅外光譜儀，德國布魯克公司; BrukerAV-600超導(dǎo)核磁共振儀，瑞士Bruker;Agilent 6890N GC，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 樣品制備方法

1.3.1 粗多糖提取工藝

稱取干燥至恒重的一定條件下粉碎的藍(lán)莓10 g，溶于一定體積的蒸餾水中，加入0.6%果膠酶，在一定溫度的水浴中浸提并不斷攪拌，取出后再以3000 r/min離心10 min，棄去下層不溶物，取上清液，加入無水乙醇至乙醇濃度為80%，冰箱中靜置過夜，取出，以3000 r/min離心10 min，取沉淀，先后用丙酮、乙醚和乙醇沖洗抽濾，真空干燥得粗多糖。

1.3.2 多糖分離純化的路線

粗多糖→雙氧水脫色→酶解和三氯乙酸正丁醇結(jié)合法脫蛋白→透析→冷凍干燥→乙醇沉淀→離心分離→乙醚，丙酮洗滌→DEAE-52纖維素柱層析→0.3 mol/L氯化鈉洗脫→Sephacryl S-300柱層析→純度鑒定。

1.3.3 樣品制備

脫色脫蛋白后的多糖通過DEAE-52纖維素柱層析，得到BBP1和BBP2、BBP3和BBP4、BBP5和BBP6六組分，BBP3含量最高，BBP3經(jīng)Sephacryl S-300葡聚糖凝膠層析進(jìn)一步分離純化兩個(gè)組分BBP3-1和BBP3-2，因BBP3-2含量很低，故先未做研究，BBP3-1經(jīng)過Sephacryl S-300葡聚糖凝膠層析柱檢測驗(yàn)證為均一多糖。

1.4 純度鑒定

1.4.1 多糖的紫外光譜(UV)分析

將多糖配成1 mg/mL的水溶液在紫外分光光度計(jì)上400～200 nm掃描。

1.4.2 Sephacryl S-300葡聚糖凝膠過濾法

將少量純品多糖溶于少量蒸餾水中，上Sephacryl S-300葡聚糖凝膠柱(Φ1.6×50 cm)。以蒸餾水洗脫，控制流速為1 mL/min，部分收集體積為4 mL/tub，以苯酚—硫酸法測OD490，做出其單一組分的鑒定洗脫曲線。

1.5 分子量的測定

高效液相色譜(HPLC)法測定多糖組分的分子量。

色譜條件:色譜柱:不銹鋼色譜柱TSK-G3000 7.8 mm(ID)×30.0 cm(L);柱溫:35℃;柱操作壓力:1.6 Mpa;流動(dòng)相:超純凈水;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

將相對(duì)分子質(zhì)量分別為 133800、410000、21400、10000和2500的Dextran系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖相繼進(jìn)樣，記錄各自的保留時(shí)間tR，在相同色譜條件，將濃度約為2.5 mg/mL多糖進(jìn)樣，記錄色譜曲線。用Shimadzu CLASS-Vp色譜工作站系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測得藍(lán)莓多糖各組分的相對(duì)分子質(zhì)量。

用HPLC測定T系列標(biāo)準(zhǔn)品各自的保留時(shí)間tR，以tR為橫坐標(biāo)，IgM(分子量對(duì)數(shù)值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。待測BBP3-1按上述相同條件進(jìn)樣，測得tR，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得待測樣品分子量。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的保留時(shí)間—IgM曲線Fig.1 The tR-IgM curve of standard dextrans

1.6 單糖組成

樣品處理:將20 mg糖樣加入到1 mL的2 mol/ L三氟乙酸放入水解管中于120℃水解3 h;放入60～80℃水汽條件下，滴加乙醇以除去剩余三氟乙酸，用pH試紙檢測中性后抽干;加0.12 mol/L碳酸鈉1 mL，1 mg肌醇，30℃處理50 min，加50 mg硼氰化鉀室溫下處理1.5 h;滴加25%乙酸中和至不產(chǎn)生氣泡(pH=6)，加入陽性離子交換樹脂除鹽2 h，用蒸餾水5～6 mL沖洗過濾，滴加甲醇除酸至中性; 85℃條件下真空除去水分;加1 mL正丙胺與1 mL無水吡啶，55℃條件下處理30 min，抽干后加入0.5 mL無水吡啶與0.5 mL乙酸酐，90℃處理1 h，抽干后用1 mL無水二氯甲烷，離心后取上清液進(jìn)行氣相檢測。

色譜條件:GC-16A，色譜柱(3.2 mm×3 m);柱溫180℃，氫氣流速45 mL/min，氮?dú)?0 mL/min，F(xiàn)ID檢測器，溫度240℃，進(jìn)樣量0.8 μL。

根據(jù)BBP3-1水解樣品的GC圖與各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖對(duì)比，可判斷單糖組成及摩爾比。

1.7 糖苷鍵及糖環(huán)構(gòu)型確定

1.7.1 藍(lán)莓多糖BBP3-1紅外光譜分析

取經(jīng)真空干燥的多糖各1～2 mg進(jìn)行溴化鉀壓片，測定其紅外光譜。

1.7.2 藍(lán)莓多糖BBP3-1的核磁分析

將BBP3-1 20 mg分別溶于0.5 mL D2O中，在600兆超導(dǎo)核磁共振儀上分別測其1H NMR和13C NMR譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度鑒定

2.1.1 紫外掃描檢測

將多糖配成1 mg/mL的水溶液在紫外分光光度計(jì)上400～200 nm掃描。由紫外光譜圖2可見，BBP3-1在280和260 nm處無吸收，表明它不含蛋白、多肽及核酸。

圖2 藍(lán)莓多糖BBP3-1的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV-scanning pattern of pure polysaccharide BBP3-1 from blueberry

2.1.2 Sephacryl S-300交聯(lián)葡聚糖凝膠柱洗脫

根據(jù)凝膠的理論知識(shí)可知，樣品中分子大的先流出凝膠柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。多糖是大分子，它的純度標(biāo)準(zhǔn)不能用通常小分子的標(biāo)準(zhǔn)來衡量。因?yàn)榧词故嵌嗵羌兤芬泊嬖谖⒂^不均一的問題，它的純度只代表某一多糖相似鏈長的平均配布。通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍內(nèi)的均一組分。多糖分子的大小和形狀不同，在層析柱中移動(dòng)速度也不同，從分部收集中出現(xiàn)的峰的多少和形狀可以判斷多糖的純度。

將少量純品多糖溶于少量蒸餾水中，上Sephacryl S-300葡聚糖凝膠柱(Φ1.6×50 cm)。以蒸餾水洗脫，控制流速為1 mL/min，部分收集體積為4 mL/tub，以苯酚-硫酸法測OD490，做出其單一組分的鑒定洗脫曲線。

圖3 BBP3-1凝膠層析曲線Fig.3 Elution pattern of BBP3-1 on SepHacryl S-300

從圖3可以看出，藍(lán)莓多糖BBP3-1經(jīng)過凝膠柱純化后，多糖的Sephacryl S-300交聯(lián)葡聚糖凝膠柱的洗脫曲線均為單一洗脫峰，且峰形對(duì)稱，結(jié)合紫外吸收光譜，證明他們均為單一組分。

2.2 分子量的測定

BBP3-1的分子質(zhì)量分布見圖4。

圖4 藍(lán)莓多糖BBP3-1的HPLC圖譜Fig.4 The HPLC atlas of blueberry polysccharide BBP3-1

由圖4分析得到:BBP3-1的重均分子量Mw為18643 Da，數(shù)均分子量Mn為9658 Da，峰位分子量Mp為 3554 Da，分子量分布寬度(Mw/Mn)為3.186。多糖BBP3-1最佳峰面積為98.271%，其他雜峰面積為0.312%和1.417%，含量非常少，也進(jìn)一步說明多糖BBP3-1的為純度較高的多糖。

2.3 單糖組成

氣相色譜分析結(jié)果見圖5，試驗(yàn)結(jié)果表明BBP3-1的單糖組成為 GalUA，Xyl和 Glu，其摩爾比為1∶1.5∶2。

圖5 藍(lán)莓多糖BBP3-1水解液的氣相色譜圖譜Fig.5 GC chromatogram spectrum of blueberry polysaccharide BBP3-1 hydrolysate

2.4 糖苷鍵及糖環(huán)構(gòu)型確定

2.4.1 藍(lán)莓多糖BBP3-1紅外光譜分析

藍(lán)莓純品多糖BBP3-1的紅外光譜見圖6，由圖6可推知，圖中3421.96 cm-1的吸收峰為O-H的伸縮振動(dòng)，2928.26、2360.28 cm-1和2340.70 cm-1為CH的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，由以上三個(gè)特征峰至少可以判斷出該物質(zhì)為多糖。1558.65 cm-1的吸收峰為COOH中的-COO的伸縮振動(dòng)，1398.26 cm-1的吸收峰為C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)，可以推測該物質(zhì)為含有糖醛酸的酸性多糖。1102.43 cm-1的吸收峰為-OH的變角振動(dòng)，958.59 cm-1的吸收峰為直立端基C-H變角振動(dòng)，可推測該物質(zhì)含有β-D-吡喃葡萄糖或半乳糖，在810 cm-1和870 cm-1處均無明顯吸收峰，說明它們均不含甘露糖，這與氣相色譜的分析結(jié)果相一致。624.64 cm-1的吸收峰為O-H外向彎曲振動(dòng)。

圖6 藍(lán)莓多糖BBP3-1的紅外吸收光譜圖Fig.6 IR spectrum of blueberry polysaccharide BBP3-1

2.4.2 藍(lán)莓多糖BBP3-1的核磁分析

2.4.2.1 BBP3-1的1H NMR分析

BBP3-1的1H NMR的化學(xué)位移大部分處于δ5.0 ppm以下，說明β構(gòu)型居多。1H NMR化學(xué)位移出現(xiàn)在δ2.01，表明有O-乙?；嬖?。δ3.40 ppm處是6-O-甲基-β-D-半乳糖的6位甲基的信號(hào)。

2.4.2.2 BBP3-1的13C NMR分析

從圖7中可以看出，多糖BBP3-113C NMR的化學(xué)位移高場區(qū)中δ19.0為鼠李糖C-6位甲基的信號(hào)。13C NMR譜中，δ62.91為C-6位的吸收峰，在δ60.01處是葡萄糖的6位發(fā)生取代的共振峰，說明此組分含6位取代的殘基，即該多糖糖鏈?zhǔn)且?，6連接的吡喃葡萄糖鏈，這與紅外分析結(jié)構(gòu)相一致。

圖7 藍(lán)莓多糖BBP3-1的核磁共振圖譜Fig.7 NMR spectrum of blueberry polysaccharide BBP3-1

3 結(jié)論

藍(lán)莓多糖BBP3-1重均分子量Mw為18643 Da，數(shù)均分子量Mn為9658 Da，峰位分子量Mp為3554 Da，分子量分布寬度(Mw/Mn)為3.186。藍(lán)莓多糖BBP3-1的氣相色譜分析確定單糖組成為:鼠李糖、半乳糖和葡萄糖，其摩爾比為:1∶1.5∶2。紅外光譜顯示多糖BBP3-1具有多糖的特征吸收峰，可推測多糖BBP3-1是含有β-D-吡喃葡萄糖或半乳糖，不含甘露糖，含有糖醛酸的酸性多糖。核磁共振分析，可推測多糖BBP3-1是以1，6連接的吡喃葡萄糖鏈為主鏈，含有鼠李糖、半乳糖和葡萄糖的β構(gòu)型多糖。

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Separation and Structural Analysis of Polysaccharides BBP3-1 from Blueberry

SUN Xi-yun1，LIU Ning2，MENG Xian-jun1*，LI Bin1，ZHANG Qi11Shenyang Agriculture University，College of Food;2Shenyang Agriculture University，College of Land and Environmental Science，Shenyang 110161，China

In this study the raw polysaccharide was obtained from Blueberry by hot water extraction and ethanol precipitation method coupled with pectinase optimum.Then it was discolored by H2O2，enzymatic hydrolyzed and then removed of protein by combining trichloroacetic acid and n-butanol.Polysaccharide(BBP3-1)was purified using DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange echromatography and Sephacryl S-300 HR gel filtration chromatography(GFC).UV spectra measurements confirmed there was no protein and nucleic acid.HPLC analysis showed that the average molecular weight (Mw)was 18643Da，the numerical average weight(Mn)was 5851 Da，the peak molecular weight(Mp)was 3554 Da，the width of molecular weight(Mw/Mn)was 3.186.GC analysis showed that the polysccharide BBP3-1 was composed of GalUA，Xyl and Glu with a molar proportion of 1∶1.5∶2.The IR and NMR spectrum analysis indicated the chain of the polysccharide BBP3-1 was dominant by 1，6-glucopyranose chain.It was an acidic β polysaccharide containing GalUA，Xyl，Glu and Rha but without Man.

blueberry;polysaccharide;isolation;structure

1001-6880(2011)06-1080-05

2010-03-30 接受日期:2010-09-10

遼寧省主要漿果深加工項(xiàng)目(遼寧省科技廳項(xiàng)目) (1102-01082609001);特色小漿果精加工關(guān)鍵技術(shù)研究(遼寧省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目)(2011205001)

*通訊作者 Tel:86-24-88488277;E-mail:mengxjsy@126.com

R28412;Q946191

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