禹峰 步雪峰 李華 張擁軍 王春友 崔靜

·論著·

整合素β1基因沉默對胰腺癌細胞PANC1體外侵襲能力的影響及機制研究

禹峰 步雪峰 李華 張擁軍 王春友 崔靜

目的應(yīng)用短發(fā)夾RNA(shRNA)沉默人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1的整合素β1(integrinβ1)基因表達，觀察其對PNAC1細胞體外侵襲能力的影響，探討其機制。方法構(gòu)建靶向integrinβ1基因的shRNA真核表達質(zhì)粒integrinβ1-shRNA及對照真核表達質(zhì)粒c-shRNA，轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC1細胞，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞作為對照組。應(yīng)用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測integrinβ1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達水平，應(yīng)用Transwell侵襲小室檢測細胞體外侵襲能力。結(jié)果integrinβ1-shRNA組、c-shRNA組和對照組細胞integrinβ1 mRNA表達量分別為0.0029±0.0004、0.0131±0.0009、0.0138±0.0005； integrinβ1蛋白表達量為0.0159±0.0062、0.3215±0.0126、0.3107±0.0094。integrinβ1-shRNA組integrinβ1 mRNA和蛋白表達抑制率分別為(78.6±7.2)%和(92.9±3.2)%(P<0.01)。而c-shRNA組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2999)。integrinβ1-shRNA組穿膜細胞數(shù)由(52±5)個降低至(21±4)個(P<0.01)；MMP-2和MMP-9 mRNA表達分別從0.592±0.073和0.847±0.069降低到0.102±0.034和0.273±0.071；MMP-2和MMP-9蛋白表達分別從0.225±0.046和0.416±0.081降低到0.059±0.013和0.106±0.022(P值均<0.05)。結(jié)論重組質(zhì)粒integrinβ1-shRNA能有效地抑制PANC1細胞integrinβ1基因的表達，并可能通過下調(diào)MMP-2和MMP-9基因表達而抑制其體外侵襲能力。

胰腺腫瘤； 整合素β1； shRNA； 腫瘤侵潤

胰腺癌早期發(fā)生局部播散和遠處轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素[1]。整合素β1(integrinβ1)是細胞黏附分子家族中的一員，在細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間的黏附及信息傳遞中起到重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞內(nèi)integrin β1表達上調(diào)是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移表型的分子學(xué)改變之一[1]。本實驗構(gòu)建靶向integrinβ1的shRNA真核表達質(zhì)粒，觀察其轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC1細胞后對細胞體外侵襲能力的影響，探討其作用機制。

材料和方法

一、重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

真核表達質(zhì)粒載體pGC-silencer-CRM30購于上海吉凱公司，含CMV啟動子，編碼GFP報告基因和neo抗性基因。靶向integrinβ1(NM_004763.3)的shRNA序列為5′-ATGGGACACGGGTGAAAATTT-3′(572-592)，攜帶GFP的對照shRNA(c-shRNA)序列為5′-CTTACGCTGAGTACTTCGA-3′，均由上海吉凱公司合成。單鏈DNA片段經(jīng)95℃退火5 min形成互補雙鏈DNA，應(yīng)用T4DNA連接酶(Promeg公司)連接至經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ(TaKaRa公司)雙酶切線性化的pGC-silencer-CRM30，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH-5大腸桿菌，通過卡那霉素篩選擴增。抽提菌液中質(zhì)粒DNA，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切及測序鑒定。

二、細胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

胰腺癌PANC1細胞株系本院普外科實驗室保存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×105個細胞接種6孔板，培養(yǎng)24 h后分為對照組、c-shRNA質(zhì)粒組和integrinβ1-shRNA質(zhì)粒組。用250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基分別稀釋10 μl Lipofecta-mineTM2000(Invitrogen公司)和4.0 g質(zhì)粒，置室溫5 min，兩液混勻置室溫20 min，均勻滴加于PANC1細胞。培養(yǎng)6 h后更換完全培養(yǎng)基。48 h后用含G418 600 g/ml的完全培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞2周。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞分別命名為integrinβ1-shRNA細胞和C-shRNA細胞。對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)。

三、細胞侵襲能力檢測

采用Transwell侵襲小室(Chemicon公司)。將對照組、c-shRNA組和integrinβ1-shRNA組細胞分別用無血清培養(yǎng)基制成1×106/ml細胞懸液，分別加入上室，每室100 μl，下室加入600 μl完全培養(yǎng)基。孵育48 h后，用棉簽擦盡上室細胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，蘇木素染色，400倍光鏡下隨機計數(shù)5個視野的平均穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

四、integrinβ1、MMP-2、MMP-9 mRNA表達檢測

采用實時PCR法檢測。應(yīng)用Trizol提取三組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。integrinβ1上游5′-TGTTCAGTGCAGAGCCTTCA-3′，下游5′-CCTCAT-ACTTCGGATTGACC-3′，擴增片段452 bp；MMP-2上游5′-GGTGCCCAAGAATAGATG-3′，下游5′-GTG-AAGTCCGAGAAGAGGA-3′，擴增片段159 bp；MMP-9上游5′-GCCCGTGAGTGGAGATGA-3′，下游5′-GGAAGGATAGGGATAAGTGT-3′，擴增片段226 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′，下游5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′，擴增片段202 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s， 45個循環(huán)，最后 72℃ 10 min，在延伸過程中搜集產(chǎn)物熒光信號。采用熒光PCR儀自帶分析程序獲取Ct值。目的基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。

五、integrinβ1、MMP-2、MMP-9蛋白表達檢測

以冰PBS洗滌細胞后收集細胞，加入預(yù)冷細胞裂解液，冰上靜止10 min，4℃、離心取上清液，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達。兔抗人Integrinβ1多抗購自美國R&D公司；鼠抗GAPDH單抗，兔抗MMP-2、MMP-9多抗，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗均購自武漢博士德公司。最后ECL發(fā)光。掃描各條帶灰度值。以各組目的蛋白與自身GAPDH灰度值比值作為蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、重組質(zhì)粒鑒定與轉(zhuǎn)染

抽提的菌液中重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，得到900 bp左右DNA 片斷，測序結(jié)果顯示插入片斷序列與實驗設(shè)計寡核苷酸序列相符(圖1)，證實integrinβ1-shRNA和c-shRNA真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-shRNA和integrinβ1-shRNA的細胞在形態(tài)上與PANC1細胞無明顯差異(圖2)。

圖1c-shRNA和integrinβ1-shRNA真核表達質(zhì)粒測序結(jié)果

圖2PANC1細胞和c-shRNA、integrinβ1-shRNA PANC1細胞在光鏡(上)和熒光顯微鏡(下)下形態(tài)(×200)

二、PANC1細胞integrinβ1 mRNA和蛋白表達的變化

integrinβ1-shRNA組、c-shRNA組和對照組細胞

integrinβ1 mRNA表達量分別為0.0029±0.0004、0.0131±0.0009、0.0138±0.0005； integrinβ1蛋白表達量為0.0159±0.0062、0.3215±0.0126、0.3107±0.0094(圖3)。integrinβ1-shRNA組細胞integrinβ1 mRNA和蛋白表達抑制率分別為(78.6±7.2)%和(92.9±3.2)%，與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而c-shRNA組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2999)。

圖3 PANC1細胞integrinβ1蛋白的表達

三、PANC1細胞體外侵襲能力的變化

integrinβ1-shRNA組、c-shRNA組和對照組的穿膜細胞數(shù)分別為(21±4)、(47±8)、(52±5)個，integrinβ1-shRNA組細胞侵襲力顯著降低(P<0.01)，而對照組與c-shRNA組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2705)。

四、PANC1細胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達的變化

與對照組細胞相比，integrinβ1-shRNA組細胞的MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)，而c-shRNA組細胞無顯著變化(P=0.9285，表1)。

表1 各組細胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達

注：與對照組比較，aP<0.05

討 論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟共同作用的連續(xù)過程，其中腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的黏附是發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的首要步驟[2]。整合素(integrins)作為ECM的受體，通過介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與ECM間識別并結(jié)合，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用。integrins是由α和β兩個亞基組成的異二聚體，參與細胞的多種生理功能和病理過程[3]。其β1亞基可分別與α1、α5、αv等亞基組合構(gòu)成相應(yīng)的integrinβ1分子，與其配體Ⅳ型膠原蛋白、纖維黏素(FN)和層黏連蛋白(LN)等結(jié)合，調(diào)節(jié)多種細胞功能及腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。integrinβ1高表達或活性增強可促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。Sawai等[4]報道，integrinβ1表達與胰腺癌的TNM 分期、肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后呈正相關(guān)。本實驗將靶向integrin β1的shRNA插入到pGC-silencer-CRM30質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC1細胞，結(jié)果顯示，integrinβ1-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PANC1細胞的integrinβ1 mRNA及蛋白表達水平顯著被抑制，細胞的侵襲能力顯著下降。

MMP-2和MMP-9是MMPs家族重要成員之一，屬鋅離子依賴性明膠酶，參與ECM降解過程，其表達增高是腫瘤細胞遷移、浸潤基質(zhì)的前提，與腫瘤細胞侵襲性密切相關(guān)[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，integrinβ1不僅能夠增強MMP-2和MMP-9 mRNA的穩(wěn)定性，而且能上調(diào)其表達；若失去integrinβ1的作用，其mRNA將很快降解，不能翻譯成蛋白產(chǎn)物。本實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細胞的MMP-2和MMP-9表達水平顯著降低，提示integrinβ1參與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程可能與其下調(diào)MMPs的表達相關(guān)。

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2010-11-01)

(本文編輯：屠振興)

Effectsofintegrinβ1genesilencingoninvasionofhumanpancreaticcancercellsPANC1

YUFeng,BUXue-feng,LIHua,ZHANGYong-jun,WANGChun-you,CUIJing.

DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

YUFeng,Email:yfengyfeng@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of integrin β1 gene expression inhibited by short hairpin RNA (shRNA) on invasion of pancreatic carcinoma PANC1 cells in vitro, and investigate the mechanism.MethodsThe eukaryotic expression plasmid of shRNA targeting integrin β1 gene (integrin β1 shRNA) and control eukaryotic expression plasmid shRNA (c-shRNA) was constructed and was transfected into PANC1 cells. The cells without plasmid transfection were used as control. The expressions of integrinβ1, MMP 2, MMP 9 mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blotting. The invasive ability of PANC1 cells was observed with Transwell cell culture chamber.ResultsIntegrinβ1 mRNA expressions in integrinβ1 shRNA group, c-shRNA group and control group were 0.0029±0.0004, 0.0131±0.0009, 0.0138±0.0005; the expressions of integrinβ1 protein were 0.0159±0.0062, 0.3215±0.0126, 0.3107±0.0094; the inhibitory rate of integrinβ1 mRNA and protein expression in integrinβ1 shRNA group was (78.6±7.2)% and (92.9±3.2)% (P<0.01). But there was no difference between the c-shRNA group and control group (P=0.2999). Number of penetrating cells in integrinβ1 shRNA group decreased from 52±5 to 21±4 (P<0.01); the expression of MMP2 and MMP 9 mRNA decreased from 0.592±0.073, 0.847±0.069 to 0.102±0.034, 0.273±0.071; the expression of MMP2 and MMP 9 protein decreased from 0.225±0.046, 0.416±0.081 to 0.059±0.013, 0.106±0.022(P<0.05).ConclusionsRecombinant integrinβ1 shRNA expression plasmid can effectively inhibit the expression of integrinβ1 gene and suppress the invasion of PANC1 cells in vitro by down-regulating MMP 2 and MMP 9 gene expression.

Pancreatic neoplasms; Integrinβ1; Short hairpin RNA; Neoplasm invasiveness

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.006

212002 江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科(禹峰、步雪峰、李華、張擁軍)； 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科(王春友、崔靜)

禹峰，Email:yfengyfeng@126.com