李東哲 趙梅芬 宋少偉 許元鴻 郭克建

·論著·

TMPRSS4在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

李東哲 趙梅芬 宋少偉 許元鴻 郭克建

目的檢測Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用實時PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測16例胰腺癌和配對癌旁組織TMPRSS4 mRNA和蛋白表達；采用免疫組織化學法檢測61例胰腺癌標本、26例配對癌旁組織、4例正常胰腺組織TMPRSS4蛋白的表達，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果胰腺癌組織TMPRSS4 mRNA和蛋白表達明顯高于配對癌旁組織(9.09±7.01比1.27±0.72；1.223±0.125比0.667±0.106，P值均<0.01)，胰腺癌組織TMPRSS4蛋白陽性表達率為67.2%(41/61)，顯著高于癌旁組織3.8%(1/26)的陽性表達率(P<0.01)。正常胰腺組織未見TMPRSS4蛋白表達。胰腺癌TMPRSS4表達與患者年齡、性別及腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān),而與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)(P值均<0.05)。結(jié)論胰腺癌組織高表達TMPRSS4，其表達與腫瘤的惡性程度相關(guān)。

胰腺腫瘤； 免疫組織化學； TMPRSS4

Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶4(type Ⅱ transmem-brane serlne proteases，TMPRSS4)是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族(TTSPs)中的新成員。有研究提示，TMPRSS4通過促進上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變(epithelial-to-mesenchymal transitions, EMT)引起腫瘤細胞的浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移[1]。本實驗檢測胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織中TMPRSS4 mRNA和蛋白的表達，探討其與臨床病理特征的關(guān)系。

材料與方法

一、一般資料

61例胰腺癌標本取自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2005年1月至2009年10月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的胰腺導(dǎo)管腺癌標本，其中男39例，女22例；年齡39～74歲，平均58歲；術(shù)前未行放療及化療。取26例配對胰腺癌旁組織及4例正常胰腺組織(胰腺良性腫瘤手術(shù)時取的正常胰腺組織)作為對照。另取16例手術(shù)切除的新鮮胰腺癌及配對癌旁組織標本，立即置液氮罐中備用。

二、TMPRSS4 mRNA檢測

取凍存的16例胰腺癌及配對癌旁組織各約100 mg，研磨成粉末狀，應(yīng)用一步法RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)抽提組織總RNA，分光光度法測定其純度與濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時定量PCR法檢測TMPRSS4 mRNA。TMPRSS4引物序列：上游5′-CCGATGTGTTCAACTGGAAG-3′,下游5′-GAGAAAGTGAGTGGGAACTG-3′，擴增長度157 bp；內(nèi)參照β-actin引物序列：上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGT-CATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴增長度186 bp。引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)條件： 95℃ 30 s，94℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，共40個循環(huán)。胰腺癌或相應(yīng)癌旁組織△Ct值與4例正常胰腺的△Ct均值相比得出△△Ct，TMPRSS4 mRNA表達的RQ值=2-△△Ct。

三、TMPRSS4蛋白檢測

1．蛋白質(zhì)印跡法：用全細胞裂解液提取凍存組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。TMPRSS4多抗(Protein Tech公司)工作濃度1∶1000，GAPDH工作濃度1∶400，最后ECL發(fā)光。采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，TMPRSS4與GAPDH條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

2．免疫組織化學染色法：61例固定標本切片后采用SP法進行免疫組化染色。TMPRSS4多抗(Protein Tech公司)工作濃度1∶50。PBS替代一抗作為陰性對照。TMPRSS4定位于細胞膜。鏡下計算陽性細胞的百分率及觀察染色強度。陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；淡黃色為1分，黃色2分，棕或褐黃色為3分。兩者相加，≥4分為陽性，≤3分為陰性。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、TMPRSS4 mRNA和蛋白表達

16例胰腺癌和癌旁組織TMPRSS4 mRNA相對表達量分別為9.09±7.01和1.27±0.72；TMPRSS4蛋白表達量分別為1.223±0.125和0.667±0.106(圖1)。胰腺癌組織TMPRSS4 mRNA和蛋白表達均顯著高于癌旁組織(P值均<0.01)。

N：癌旁組織，T：癌組織；#1～#4為不同配對標本編號

61例胰腺癌組織行免疫組化染色，41例(67.2%)陽性表達，其中7例Ⅲ期胰腺癌中6例陽性表達，且染色強度均呈褐黃色；26例癌旁組織中1例(3.8%)陽性表達；4例正常胰腺組織均未見TMPRSS4的表達(圖2)。

圖2胰腺癌旁組織(a)及癌組織(b)TMPRSS4表達(免疫組化 ×200)

二、TMPRSS4蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌組織TMPRSS4蛋白陽性表達與患者的年齡、性別及腫瘤位置、腫瘤大小均無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)(表1)。

表1胰腺癌組織TMPRSS4表達與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理特征例數(shù)陽性表達(41例)陰性表達(20例)P值年齡(歲，x±s)58．2±9．357．7±9．90．846性別[例，率(%)] 男3925(64．1)14(35．9)0．491 女2216(72．7)6(27．3)腫瘤部位[例，率(%)] 胰頭部4934(69．4)15(30．6)0．465 體尾部127(58．3)5(41．7)分化程度[例，率(%)] 高分化2110(47．6)11(52．4)0．013 中、低分化4031(77．5)9(22．5)腫瘤大小[例，率(%)] >3．5cm2419(79．2)5(20．8)0．109 ≤3．5cm3722(59．5)15(40．5)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[例，率(%)] N04124(58．6)17(41．4)0．039 N12017(85．0)3(15．0)TNM分期[例，率(%)] Ⅰ2511(44．0)14(56．0)0．006 Ⅱ2924(82．8)5(17．2) Ⅲ76(85．7)1(14．3)

討 論

腫瘤細胞表面的蛋白酶可以降解基底膜和細胞外基質(zhì)，使惡性腫瘤細胞向周圍相鄰組織浸潤，這是腫瘤轉(zhuǎn)移的多階段進程中非常重要的事件[2-3]。絲氨酸蛋白酶是最為古老和最為龐大的蛋白酶家族之一。新近發(fā)現(xiàn)一類特殊蛋白酶——具有單跨膜結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶，被稱為Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(TTSPs)[4]。因TTSPs位于細胞的表面，故可以在細胞內(nèi)與細胞外基質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起調(diào)控作用。TMPRSS4是由Wallrapp等在2000年從胰腺癌組織中分離出的一個新的TTSP[5]。TMPRSS4過表達的腫瘤細胞形態(tài)會出現(xiàn)改變，如細胞膜的邊緣波動和板狀偽足的形成。目前已經(jīng)證實，上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變(EMT)可促進腫瘤細胞的浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移[6]。在結(jié)腸癌細胞中，TMPRSS4正是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT促進腫瘤細胞的浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移[1]。TMPRSS4調(diào)控的下游信號通路有FAK、ERK、Akt、Src和Rac1。其中FAK信號通路和ERK的活性是TMPRSS4誘導(dǎo)的浸潤和EMT的必要條件[7]。

Wallrapp等[5]報道，TMPRSS4 mRNA在胰腺癌中高表達，而正常胰腺及慢性胰腺炎組織中無TMPRSS4 mRNA的表達。本實驗結(jié)果與其一致。姚曉峰等[8]報道，甲狀腺癌TMPRSS4 mRNA的表達水平與患者性別、年齡及腫瘤大小、不同病理類型無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同臨床分期相關(guān)(P<0.01)。Kim等[7]報道，結(jié)腸癌組織TMPRSS4 mRNA表達較癌旁正常黏膜組織明顯增高，且TMPRSS4表達的增高與腫瘤的不同分期相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，胰腺癌組織TMPRSS4 mRNA及蛋白的表達顯著高于癌旁組織，胰腺癌TMPRSS4的蛋白表達與患者的年齡、性別及腫瘤大小、病理類型無關(guān)，而與淋巴轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)，而且7例Ⅲ期胰腺癌中有6例呈強陽性表達，提示TMPRSS4可能在胰腺非浸潤性腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榻櫺阅[瘤中起著一定作用。本組胰腺癌TMPRSS4陽性表達率為67.2%，而癌旁組織表達僅為3.8%，提示檢測胰腺組織TMPRSS4表達對于胰腺癌的診斷可能有一定的幫助。

[1] Jung H,Lee KP,Park SJ,et al.TMPRSS4 promotes invasion,migration and metastasis of human tumorcells by facilitating an epithelial-mesenchymal transition.Oncogene,2008,27:2635-2647.

[2] Stetler-Stevenson WG, Yu AE. Proteases in invasion: matrix metalloproteinases. Semin Cancer Biol, 2001,11:143-152.

[3] Deryugina EI,Quigley JP. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis.Cancer Metastasis Rev,2006,25:9-34.

[4] Hooper JD,Clements JA,Quigley JP,et al.Type II transmembrane serine proteases.Insights into an emerging class of cell surface proteolytic enzymes.J Biol Chem,2001,276:857-860.

[5] Wallrapp C, Hahnel S, Muller-Pillasch F,et al. A novel transmembrane serine protease (TMPRSS3) overexpressed in pancreatic cancer. Cancer Res, 2000,60:2602-2606.

[6] Christiansen JJ,Rajasekaran AK.Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis. Cancer Res,2006,66:8319-8326.

[7] Kim S, Kang HY, Nam EH,et al. TMPRSS4 induces invasion and epithelial-mesenchymal transition through upregulation of integrin 5 and its sinaling pathways. Carcinogenesis, 2010，31:597-606.

[8] 姚曉峰，張侖,鄭紅,等.跨膜絲氨酸蛋白酶4和癌胚纖維連接蛋白在甲狀腺癌中的表達.中華實驗外科雜志，2008,25:263-263.

2010-11-23)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionofTMPRSS4inpancreaticcancerandclinicalsignificance

LIDong-zhe,ZHAOMei-fen,SONGShao-wei,XUYuan-honng,GUOKe-jian.

DepartmentofPancreaticSurgery,FirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

GUOKe-jian,Email:mfb790726@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of TMPRSS4 mRNA, protein in human pancreatic cancer tissues and to explore the relationship between the expression of TMPRSS4 protein and the clinicopathologic parameters.MethodsReal-time PCR and Western blotting were used to detect the expressions of TMPRSS4 mRNA and protein in 16 samples of pancreatic cancer tissues and adjacent normal pancreatic tissues. The expression of TMPRSS4 protein in 61 samples of pancreatic cancer tissues and 26 samples of adjacent pancreatic tissues and 4 samples of normal pancreatic tissues was detected by using immunohistochemistry and its relationship with clinicopathological features was analyzed.ResultsThe expression of TMPRSS4 mRNA and protein of pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in adjacent pancreatic tissues (9.09±7.01vs. 1.27±0.72; 1.223±0.125vs. 0.667±0.106,P<0.01); the expression rate of TMPRSS4 protein of pancreatic cancer tissues was 67.2%(41/61), which were significantly higher than that in adjacent pancreatic tissues [3.8%(1/26),P<0.01]. There was no TMPRSS4 protein expression in normal pancreatic tissues. There was no significant correlation between the expression of TMPRSS4 protein and the age, gender, tumor location or tumor size was found. There was significant correlation between the expression of TMPRSS4 protein and the degree of differentiation, lymph node metastasis, and clinical staging (P<0.05).ConclusionsTMPRSS4 protein is highly expressed in pancreatic cancer tissues, and the expression of TMPRSS4 is associated with the degree of malignancy of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Immunohistochemistry; TMPRSS4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.003

110001 沈陽，中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胰腺外科

郭克建，Email: mfb790726@163.com