衛(wèi)巍 徐凌 王鋒 何珊珊 楊麗娟 郭傳勇 王興鵬

·論著·

IRX1在胰腺癌中的表達(dá)及其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

衛(wèi)巍 徐凌 王鋒 何珊珊 楊麗娟 郭傳勇 王興鵬

目的檢測胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表達(dá)及其啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，探討兩者間的相關(guān)性。方法采用實時PCR法檢測12例胰腺癌組織及6株胰腺癌細(xì)胞株的IRX1 mRNA表達(dá)?；蛐蛄蟹治鯥RX1基因啟動子區(qū)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用甲基化抑制劑5- 氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理胰腺癌細(xì)胞，采用甲基化特異性PCR(MSP)、非甲基化特異性PCR(USP)及實時PCR檢測處理前后IRX1啟動子甲基化狀態(tài)和IRX1 mRNA表達(dá)。結(jié)果胰腺癌組織IRX1 mRNA的表達(dá)量為0.31±0.11，顯著低于癌旁正常胰腺組織的1.05±0.32(P<0.01)。胰腺癌細(xì)胞AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表達(dá)量分別為0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02，均顯著低于人腎上皮293細(xì)胞的1.03±0.28(P<0.05或<0.01)。IRX1基因啟動子區(qū)富含CpG島。各胰腺癌細(xì)胞株IRX1基因啟動子CpG島對應(yīng)位點均有甲基化，經(jīng)5-Aza-dC處理后甲基化狀態(tài)得以逆轉(zhuǎn)，IRX mRNA的表達(dá)也得以恢復(fù)。結(jié)論胰腺癌的IRX1mRNA表達(dá)下降，與其IRX1基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化狀態(tài)相關(guān)。

胰腺腫瘤； 啟動子； 甲基化； IRX1

易洛魁族同源盒(iroquois homeobox, IRX)基因最早在果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究中被發(fā)現(xiàn)，編碼一個含高度保守同源盒序列的三氨基酸環(huán)延伸(three amino acid extension, TALE)超家族蛋白[1-2]。人類IRX家族成員共有6種，根據(jù)染色體的定位分為兩簇，其中IRX1基因位于5號染色體短臂5p15.33區(qū)，該區(qū)域在多種腫瘤中均存在不穩(wěn)定性[3-5]。 IRX1在頭頸項腫瘤和胃癌的研究中常表達(dá)降低[6]，并與腫瘤的形態(tài)學(xué)和臨床表型存在一定相關(guān)性。本研究測定胰腺癌、癌旁組織及各胰腺癌細(xì)胞株中該基因的表達(dá)水平，分析IRX1基因調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)，為闡明其在胰腺癌發(fā)生及進(jìn)展過程中的分子作用機(jī)制提供一定的實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細(xì)胞株AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990為本實驗室保存，常規(guī)培養(yǎng)，傳代。待細(xì)胞生長到指數(shù)階段時用終濃度為0.5 μmol/L的5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理5 d，以未干預(yù)的細(xì)胞作為對照組，收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞。12例胰腺癌及癌旁正常組織為上海第十人民醫(yī)院保存的經(jīng)病理證實的2006年至2009年間手術(shù)切除標(biāo)本。應(yīng)用Trizol試劑(上海英駿生物技術(shù)公司)抽提細(xì)胞及組織總RNA；應(yīng)用酚氯仿法常規(guī)抽提各細(xì)胞株基因組DNA。

二、方法

1．實時PCR法測定IRX1 mRNA表達(dá)：應(yīng)用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物。IRX1引物序列上游 5′-AGTTAAAGTCGCCCTTCCAG-3′，下游5′-CCC-CGCAAAAGTAAAAGAAGAC-3′，擴(kuò)增片段120 bp；內(nèi)參β-actin引物序列上游 5′-CTGGAACGGTGA-AGGTGACA-3′，下游5′-AAGGGACTTCCTGTAACA-ATGCA-3′，擴(kuò)增片段140 bp。引物序列由上海生工生物工程公司合成。運用ABI7900HT PCR儀進(jìn)行實時PCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60℃ 1 min，35個循環(huán)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt處理后進(jìn)行分析[7]。

2．IRX1基因結(jié)構(gòu)分析：利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Splign分析IRX1基因的序列；Ensemble數(shù)據(jù)庫分析IRX1轉(zhuǎn)錄本的5′-upstream序列，尋找啟動區(qū)的典型結(jié)構(gòu)；MethPrimer軟件分析啟動子區(qū)CpG島的狀況。

3．IRX1基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)分析：采用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR, MSP)和非甲基化特異性PCR(unmethylation-specific PCR,USP)法檢測。取500 ng純化DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。MethPrimer軟件設(shè)計IRX1啟動子CpG島MSP及USP引物。MSP上游5′-GTTGTT-ATTAGCGTTTAGGTCGTC-3′，下游5′-ATCTAACAC-CGAATTTACAATTTCG-3′，擴(kuò)增片段127 bp；USP上游5′-TTGTTATTAGTGTTTAGGTTGTTGG-3′，下游5′-CTATCTAACACCAAATTTACAATTTCAC-3′，擴(kuò)增片段128 bp。選用Hotstar Taq酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，35個循環(huán)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織及細(xì)胞株的IRX1 mRNA表達(dá)

胰腺癌組織IRX1 mRNA的表達(dá)量為0.31±0.11，顯著低于癌旁正常胰腺組織的1.05±0.32(P<0.01)。胰腺癌細(xì)胞AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表達(dá)量分別為0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02，均顯著低于對照組的人腎上皮293細(xì)胞的1.03±0.28(P<0.05或<0.01)，其中PANC1細(xì)胞的表達(dá)最低。

二、IRX1基因結(jié)構(gòu)

IRX1基因由4個不同大小的外顯子構(gòu)成，僅存在一種轉(zhuǎn)錄本模式，其轉(zhuǎn)錄起始點(transcription start site，TSS)上游的啟動子區(qū)GC含量高達(dá)60%以上，存在多個CpG位點，長度超過600 bp(圖1)。

圖1 IRX1基因序列分析圖

三、各胰腺癌細(xì)胞株IRX1基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)

各胰腺癌細(xì)胞株IRX1基因啟動子CpG島對應(yīng)位點均有甲基化，其中PANC1和PaTu8988兩株細(xì)胞USP條帶幾乎不可見(圖2)。

M: MSP；U: USP；1: AsPC1; 2: BxPC3；3: Capan-2; 4: PANC1; 5: SW1990; 6: PaTu8988

圖2胰腺癌細(xì)胞株IRX1基因調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)

四、5-Aza-dC處理后各胰腺癌細(xì)胞株IRX1基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及IRX1 mRNA表達(dá)的變化

經(jīng)5-Aza-dC處理后，各胰腺癌細(xì)胞株的IRX1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化程度均有大幅降低(圖3)；AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990細(xì)胞IRX1 mRNA表達(dá)量分別為3.04±0.53、2.24±0.39、2.26±0.28、2.43±0.26、2.64±0.97、1.79±0.05，均較未處理組的1.02±0.22、1.02±0.21、1.04±0.33、1.06±0.46、1.00±0.08、1.02±0.23顯著上調(diào)(P<0.05或<0.01)。

M: MSP; U: USP; 1: AsPC1; 2: BxPC3; 3: Capan-2; 4: PANC1; 5: SW1990; 6: PaTu8988

圖35-Aza-dC處理后胰腺癌細(xì)胞株IRX1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)

討 論

胰腺癌作為病死率最高的人類腫瘤之一，其發(fā)生進(jìn)展是一個涉及多種基因的多階段、多步驟的復(fù)雜的生物學(xué)過程[8]。DNA甲基化是其中一種精確的調(diào)控方式，是真核細(xì)胞正常而普遍的修飾方式，是哺乳動物表達(dá)調(diào)控的主要表遺傳學(xué)形式，是將基因型與表型聯(lián)系起來的一條紐帶[9-10]。研究表明，遺傳表型改變，特別是抑癌基因啟動子區(qū)域內(nèi)CpG島出現(xiàn)異常甲基化而失活參與了部分胰腺癌的發(fā)生過程[11]。目前認(rèn)為啟動子區(qū)CpG島高甲基化可能引起轉(zhuǎn)錄抑制，因此DNA啟動子區(qū)域的甲基化被看作是腫瘤抑制基因失活的主要機(jī)制[12]。

本實驗結(jié)果顯示，胰腺癌組織及各胰腺癌細(xì)胞

株中IRX1 mRNA表達(dá)水平均較正常胰腺組織顯著降低。通過對IRX1基因序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)GC含量較高，并存在一個長度超過600 bp的CpG島，我們推測IRX1基因CpG島的高甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)的主要原因。為此，本研究檢測各胰腺癌細(xì)胞株中IRX1基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示所有6株腫瘤細(xì)胞株IRX1基因啟動子CpG島對應(yīng)位點均有不同程度的甲基化。應(yīng)用5-Aza-dC處理后，IRX1基因的甲基化得到逆轉(zhuǎn)，IRX1 mRNA的表達(dá)得到很大程度的恢復(fù)，證實異常甲基化是胰腺癌中抑癌基因IRX1失活的機(jī)制之一。

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2010-11-04)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionandmethylationofIroquoishomeoboxprotein1inpancreaticcancer

WEIWei,XULing,WANGFeng,HEShan-shan,YANGLi-juan,GUOChuan-yong,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTenthPeople′sHospital,TongjiUniversity,Shanghai200072,China

WANGXing-peng,Email：wangxingpeng@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression of Iroquois homeobox protein 1 (IRX1) gene and the hypermethylation status of its promoter in pancreatic cancer, and their relationship.MethodsReal-time PCR was used to quantitatively detect IRX1 gene expression level of 12 sets of resected pancreatic cancer tissue and 6 sets of pancreatic cancer cell lines; gene sequences analysis was used to detect the structure of IRX1 promoter; DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC) was used in pancreatic cancer cell lines, and then the methylation of IRX 1 was measured by methylation-specific PCR (MSP) and unmethylation sequence-PCR (USP) methods.ResultsExpression of IRX1 mRNA in pancreatic cancer tissue was 0.31±0.11, which were significantly lower than that in normal pancreatic tissue (1.05±0.32,P<0.01). IRX1 mRNA expression of AsPC1, BxPC3, Capan 2, PANC1, PaTu8988 and SW1990 were 0.36±0.08, 0.34±0.16, 0.37±0.11,0.25±0.06, 0.31±0.04, 0.36±0.02, which were significantly lower than that in human kidney epithelial 293 cells (1.03±0.28,P<0.05 or <0.01). Analysis of IRX1 gene sequence showed abundant CpG islands in promoter. Hypermethylation of IRX1 promoter site was found in all pancreatic cancer cell lines. However, its methylation status could be reversed by 5-Aza-dC, and the IRX1 expression was also restored.ConclusionsIRX1 mRNA expression is down-regulated in pancreatic cancer, and it is related with promoter CpG islands hypermethylation.

Pancreatic neoplasms； Promoter； Methylation； IRX1

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.002

國家自然基金(81072065)；上海市科委基金(08411963000, 09410705400)

200072 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科

王興鵬，Email：wangxingpeng@hotmail.com