彭凱 孔心涓 田字彬 張翠萍 趙清喜 魏良洲 王斌

·論著·

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的影響

彭凱 孔心涓 田字彬 張翠萍 趙清喜 魏良洲 王斌

目的探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響。方法采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度EGCG(6.25、12.5、25、50、100 μg/ml)對(duì)體外培養(yǎng)的SW1990細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGCG(25 μg/ml)對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡及不同濃度的EGCG(0、10、20、30、40、50 μg/ml)對(duì)SW1990細(xì)胞周期的影響。結(jié)果不同濃度EGCG (0、25、50 μg/ml)作用SW1990細(xì)胞24 h后，吸光度值(A492)分別為0.46±0.04、0.42±0.04、0.27±0.03，48 h后分別為0.48±0.02、0.31±0.03、0.16±0.02，72 h后分別為0.51±0.01、0.24±0.04、0.14±0.04，EGCG呈濃度及時(shí)間依賴性抑制SW1990的增殖(P<0.01)。25 μg/ml EGCG作用于SW1990細(xì)胞24、48、72 h后的細(xì)胞凋亡率分別為(8.33±1.15)%、(19.77±0.81)%、(29.17±0.75)%，而對(duì)照組相應(yīng)的細(xì)胞凋亡率分別為(2.77±0.45)%、(3.20±0.26)%、(3.67±0.35)%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。0、20、50 μg/ml EGCG作用SW1990 細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞分別占(57.59±0.97)%、(62.99±1.91)%、(68.87±1.88)%，隨著EGCG 濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，而S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)下降(P<0.01)。結(jié)論EGCG能明顯抑制SW1990細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞凋亡及調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。

胰腺腫瘤； 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞周期

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallae, EGCG)是茶多酚中比例最大、活性最高的單體成分[1]，對(duì)人和動(dòng)物沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)[2]。已有實(shí)驗(yàn)研究表明，EGCG對(duì)直腸癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤均有促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本研究觀察EGCG對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的生長(zhǎng)抑制、凋亡作用，探討其可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、胰腺癌細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存。常規(guī)培養(yǎng)傳代。

二、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌細(xì)胞SW1990，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%～80%融合后加入新鮮配置的EGCG(成都曼思特生物科技有限公司，純度為99%)，終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入5 mg/ml的MTT(Sigma公司)溶液20 ml，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲亞砜，避光室溫下充分震蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定492 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值。

三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照Annexin Ⅴ-PE+7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Millipore Guava technologies公司)說(shuō)明書(shū)操作。SW1990細(xì)胞培養(yǎng)36 h后加入新鮮配制的25 μg/ml的EGCG，以不加EGCG作為對(duì)照，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后收集細(xì)胞。離心后用100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入100 μl Guava Nexin Reagent避光孵育20 min，應(yīng)用Guava EasyCyte Mini 0500-1430流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

按照Guava?細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Millipore Guava Technologies公司)說(shuō)明書(shū)操作，待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%～80%融合后換無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h以周期同步化，之后分別加入10、20、30、40、50 μg/ml的EGCG繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加EGCG的細(xì)胞作為對(duì)照。胰酶消化、離心收集細(xì)胞，PBS洗滌后以100 μl PBS重懸細(xì)胞，逐滴加入-20℃的70%冰乙醇，4℃固定過(guò)夜。然后離心棄上清，PBS洗滌加入200 μl細(xì)胞周期試劑液重懸細(xì)胞，室溫孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、EGCG對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

6.25、12.5 μg/ml EGCG對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，25 μg/ml以上EGCG呈濃度及時(shí)間依賴性抑制SW1990的增殖(圖1)。倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、皺縮、胞質(zhì)減少、核質(zhì)比例增大、細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙明顯增大(圖2)。

圖1 不同濃度EGCG對(duì)SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

圖250 μg/ml EGCG作用24(a)、48(b)、72 h(c)后SW1990的形態(tài)(×100)

二、EGCG對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后凋亡率波動(dòng)于(2.77±0.45)%～(3.67±0.35)%，無(wú)明顯變化。25 μg/ml EGCG作用24、48、72 h后細(xì)胞凋亡率分別為(8.33±1.15)%、(19.77±0.81)%、(29.17±0.75)%，均較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞不斷增加(P<0.01)。

三、EGCG對(duì)SW1990細(xì)胞周期的影響

EGCG作用后SW1990細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加(P值<0.05或<0.01)，且高濃度EGCG(30、40、50 μg/ml)導(dǎo)致的G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加較低濃度EGCG(10、20 μg/ml)更顯著(P<0.01)；同時(shí)，S期細(xì)胞及G2/M期細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組明顯減少(P值均<0.01，表1)。

組 別G0/G1期S期G2/M期對(duì)照組57．59±0．9720．05±0．2022．35±1．0410μg/ml組61．78±2．03a19．29±0．9818．91±1．14b20μg/ml組62．99±1．91b18．81±1．2718．19±0．78b30μg/ml組68．48±3．47bc15．49±1．50b16．03±1．98b40μg/ml組67．63±0．48bc14．64±0．51b17．72±0．88b50μg/ml組68．87±1．88bc14．56±0．22b16．57±1．76b

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與10、20 μg/ml組比較，cP<0.01

討 論

茶葉中富含多酚類化合物，茶多酚化合物包括黃烷醇、黃酮類和茶多酚酸類，其中黃烷醇約占到多酚類物質(zhì)總量的80%，通稱為茶兒茶素。茶兒茶素主要包括表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素，其中以EGCG為主要成分，含量約占到茶兒茶素的50%，是茶多酚中比例最大、活性最高的單體成分[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2]，EGCG對(duì)胃癌、肝癌、食管癌、直腸結(jié)腸癌、皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌及前列腺癌等腫瘤均有促凋亡及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響。流行病學(xué)亦證實(shí)飲用綠茶可以防治腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[3]，Yuan等[4]在上海對(duì)18 244人進(jìn)行的前瞻性隊(duì)列研究證實(shí)，茶兒茶素能有效防止人結(jié)腸癌的發(fā)生。Tan等[5]研究亦發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制人胰腺癌PANK-1細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG(>25 μg/ml)呈時(shí)間-劑量依賴性對(duì)SW1990細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，且細(xì)胞凋亡率增加。

腫瘤細(xì)胞的一個(gè)共同特征是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)。眾多的癌基因、抑癌基因參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、死亡的調(diào)控，最終表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。細(xì)胞周期存在兩個(gè)主要的限制點(diǎn)：G0/G1、G2/M限制點(diǎn)，其中G0/G1限制點(diǎn)是影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵，只要有相應(yīng)的生長(zhǎng)因子存在，G1期正調(diào)節(jié)因子累積達(dá)到一定程度，細(xì)胞就能通過(guò)該限制點(diǎn)進(jìn)入S期，一旦越過(guò)該點(diǎn)，細(xì)胞就不再依賴細(xì)胞外促生長(zhǎng)因子而依次完成整個(gè)細(xì)胞周期。G2/M限制點(diǎn)與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG可使SW1990細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，相應(yīng)的G2/M期細(xì)胞比例減小，當(dāng)EGCG濃度>30 μg/ml時(shí)相應(yīng)的S期細(xì)胞比例也降低，推測(cè)EGCG可能通過(guò)誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞SW1990使之阻滯于G0/G1期而發(fā)揮其抑制增殖的效應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 方芳，崔志清，韓永晶.茶兒茶素的藥效研究概況．中草藥，2000,31:396-398.

[2] Johnson JJ,Bailey HH,Mukhtar H.Green tea polyphenols for prostate cancer chemoprevention:a translational perspective.Phytomedicine,2010,17:3-13.

[3] Yang CS,Wang ZY.Tea and cancer.J Natl Cancer Inst,1993,85:1038-1049.

[4] Yuan JM,Gao YT,Yang CS,et al.Urinary biomarkers of tea polyphenols and risk of colorectal cancerin the Shanghai Cohort Study.Int J Cancer,2007,120:1344-1350.

[5] Tan M,Norwood A,May M,et al.Effects of (-)epigallocatechin gallate and thymoquinone on proliferation of a PANC1 cell line in culture.Biomed Sci Instrum,2006,42:363-371.

2010-11-30)

(本文編輯：呂芳萍)

Anti-proliferativeeffectofepigallocatechin-3-gallateonhumanpancreaticcancercellSW1990

PENGKai,KONGXin-juan,TIANZi-bin,ZHANGCui-ping,ZHAOQing-xi,WEILiang-zhou,WANGBin.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,China

TIANZi-bin,Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

ObjectiveTo investigate the apoptosis-inducing effect and anti-proliferative effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on human pancreatic cancer cell SW1990 in vitro.MethodsThe effect of proliferationwas evaluated by MTT after the SW1990 cells in vitro were incubated with different concentrations of EGCG (6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml). The apoptosis-inducing effect was determined by flow cytometry after the cells were treated with 25 μg/ml of EGCG. The cell cycle of SW1990 cells was detected by flow cytometry after the cells incubated with different concentrations of EGCG (0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml).ResultsAfter SW1990 cell were treated with different concentrations of EGCG(0, 25, 50 μg/ml), the values of A492were 0.46±0.04,0.42±0.04,0.27±0.03 at 24 h; 0.48±0.02, 0.31±0.03,0.16±0.02at 48 h; 0.51±0.01,0.24±0.04,0.14±0.04 at 72 h. EGCG inhibited the proliferation of SW1990 in a dose- and time-dependant manner(P<0.01). The apoptotic rates at 24, 48, 72 h were (8.33±1.15)%, (19.77±0.81)%, (29.17±0.75)% in the EGCG treatment group; while the corresponding values were (2.77±0.45)%,(3.20±0.26)%, (3.67±0.35)% in the control group; and the difference was statistically significant (P<0.01). After 0, 20, 50 μg/ml of EGCG treatment for 24 h, the percentages of

SW1990 cellsin G0/G1stage were (57.59±0.97)%, (62.99±1.91)%, (68.87±1.88)%, and the percentages of SW1990 cells in G0/G1stage increased with the increase of concentrations of EGCG, while the percentages of SW1990 cells in G2/M stage decreased with the increase of concentrations of EGCG (P<0.01).ConclusionsEGCG can significantly inhibit the proliferation of SW1990 cells. The mechanism may be related to the apoptosis-inducing effect and the regulation of the cell cycle of the SW1990 cells.

Pancreatic neoplasms； Epigalocatechin-3 gallate； Apoptosis； Cell cyle

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.008

266003 青島市，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(彭凱、孔心涓、田字彬、張翠萍、趙清喜、魏良洲)；青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院(王斌)

彭凱，Email：eoert@163.com

田字彬，Email: tianzb@qdumh.qd.sd.cn