黃鳳婷 張世能 梁愛心 峗淑莉 莊曉虹 陳文博

·論著·

阻斷Hedgehog信號通路對人胰腺癌干細胞自我更新的影響

黃鳳婷 張世能 梁愛心 峗淑莉 莊曉虹 陳文博

目的觀察Hedgehog信號通路特異阻斷劑環(huán)巴明對胰腺癌干細胞自我更新的影響。方法應(yīng)用0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明處理胰腺癌PANC1干細胞、PANC1貼壁細胞和永生化胰腺導(dǎo)管上皮H6C7細胞 24、48、72 h。采用實時RT-PCR法檢測細胞Smo及Gli1 mRNA表達；CCK-8法檢測細胞增殖抑制；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。結(jié)果10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后，PANC1干細胞、PANC1細胞和H6C7細胞的Smo mRNA表達量分別為1、0.83、2.61； Gli1 mRNA為57.27、26.35、1；生長抑制率分別為(37.85±13.69)%、(8.53±4.43)%、(43.55±28.98)%。與PANC1細胞比較，PANC1干細胞的Smo、Gli1 mRNA 表達顯著增加，生長抑制率亦顯著增強(P值<0.05或<0.01)。經(jīng)10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h，PANC1干細胞G1期比例從(67.41±6.35)%顯著降至(36.53±6.03)% (P<0.05)，細胞凋亡率從(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)% (P>0.05)；PANC1細胞G1期比例從(67.64±6.88)%顯著降至(53.13±1.10)% (P<0.05)，細胞凋亡率從(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)% (P>0.05)；而H6C7細胞的G1期比例及凋亡無明顯變化。結(jié)論環(huán)巴明阻斷Hedgehog信號通路可抑制PANC1干細胞增殖，其機制可能與細胞凋亡無關(guān)。

胰腺腫瘤； 干細胞； Hedgehog信號通路； 自我更新

Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與胰腺胚胎發(fā)育密切相關(guān)，Bar等[1]和Zhao等[2]報道，腦膠質(zhì)瘤干細胞等腫瘤干細胞中存在此通道，它與細胞自我更新和多向分化密切相關(guān)，而且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。我們的前期研究[3-4]已成功培養(yǎng)出具有腫瘤干細胞樣特性的胰腺癌干細胞。本研究旨在觀察環(huán)巴明(cyclopamine)特異阻斷Hedgehog信號通路對人胰腺癌干細胞增殖、細胞周期及凋亡的的影響。

材料與方法

一、細胞株

人胰腺癌細胞系PANC1由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室保存；永生化胰腺導(dǎo)管上皮細胞H6C7由加拿大安大略癌癥研究所Tsao教授惠贈。PANC1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；H6C7培養(yǎng)于K-SFM混合培養(yǎng)基；PANC1細胞懸浮培養(yǎng)于含20 ng/ml EGF、5 μg/ml胰島素、0.4%BSA、1∶50 B27的DMEM-F12(1∶1) 培養(yǎng)基中獲得PANC1干細胞。

二、實時 RT-PCR檢測細胞Smo、Gli1 mRNA

用Trizol法提取PANC1干細胞、PANC1貼壁細胞和H6C7的細胞總RNA，實時 RT-PCR檢測細胞Smo、Gli1 mRNA表達，以18S rRNA為內(nèi)參照。Smo上游引物5′-CATCCCTGACTGTGAGATCA-3′，下游引物5′-CACCATCTTGGTGACATGCT-3′，擴增片段370 bp；Gli1上游引物5′-CCATACATGTGTGAGCACGA-3′,下游引物5′-GGCACAGTCAGTCTGCTTT-3′，擴增片段308 bp。PCR儀為7300型(美國ABI公司)。RT反應(yīng)條件：30℃ 10 min，42℃ 60 min，72℃ 10 min；PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。實驗重復(fù)3次。相對表達量(RQ)=2-△△Ct。

三、CCK-8法檢測細胞增殖

收集培養(yǎng)12～15 d的PANC1干細胞，消化成單細胞懸液，按每孔3×104個細胞接種于96孔板，立即分別加入到終濃度為0、0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期PANC1貼壁細胞及H6C7細胞，按每孔3×103個細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，換含0、0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。每組細胞均設(shè)2個復(fù)孔。三種細胞分別于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，測吸光度值A(chǔ)450/A630比值，計算細胞增殖抑制率。抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

四、細胞周期檢測

收集用10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h的PANC1干細胞、PANC1貼壁細胞及H6C7細胞，消化成單細胞懸液，70%乙醇固定18 h，加入RNase至終濃度為50 μg/ml及PI染液至終濃度為50 μg/ml，37℃避光孵育30 min，應(yīng)用流式細胞儀(FACSCalibur,美國Becton Dickinson公司)檢測細胞周期。

五、細胞凋亡檢測

收集用10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h的PANC1干細胞、PANC1貼壁細胞及H6C7細胞，消化成單細胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗2次，重懸細胞為106個/ml，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、細胞Smo、Gli1 mRNA表達

PANC1干細胞、PANC1貼壁細胞和H6C7細胞Smo mRNA的表達量分別為1、0.83、2.61；Gli1 mRNA表達量分別為57.27、26.35、1。其中PANC1干細胞Smo mRNA表達是PANC1貼壁細胞的154.76倍，H6C7細胞Smo mRNA表達是PANC1貼壁細胞的403.72倍；PANC1干細胞Gli1 mRNA表達是PANC1貼壁細胞的6.94倍，H6C7細胞Gli1 mRNA表達是PANC1貼壁細胞的0.14倍。與PANC1細胞比較，PANC1干細胞的Smo、Gli1 mRNA表達顯著增加(P<0.05)。

二、環(huán)巴明對細胞增殖的影響

PANC1干細胞、PANC1及H6C7細胞經(jīng)0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明作用后，細胞基本上呈劑量、時間依賴性地出現(xiàn)生長抑制。10 μmol/L環(huán)巴明作用72 h后，PANC1干細胞和H6C7細胞的生長抑制率分別為(37.85±13.69)%和(43.55±28.98)%，兩組間差異顯著(P<0.05)，且均顯著高于PANC1細胞(8.53±4.43)%的生長抑制率 (P<0.01)。

三、環(huán)巴明對細胞周期的影響

10 μmol/L環(huán)巴明作用72 h后，PANC1干細胞G1期比例從(67.41±6.35)%顯著降至(36.53±6.03)% (P<0.05)； PANC1細胞從(67.64±6.88)%顯著降至(53.13±1.10)% (P<0.05)；H6C7細胞從(62.85±4.83)%到(68.22±10.16)%，無明顯變化(圖1)。

a、c、e為環(huán)巴明處理前的細胞周期；b、d、f為10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后的細胞周期

圖1環(huán)巴明處理前后三種細胞的細胞周期

四、環(huán)巴明對細胞凋亡的影響

10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后，PANC1干細胞凋亡率從(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)%，PANC1細胞從(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)%，H6C7細胞從(2.14±1.47)%降到(1.72±1.08)%，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

自我更新是腫瘤干細胞的重要生物學(xué)特性之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[5]研究表明Hedgehog信號通路可能參與腫瘤干細胞自我更新機制，該通路的異常表達或激活可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。環(huán)巴明是Hedgehog信號通路中Smo蛋白的特異抑制劑，可通過環(huán)巴明 阻斷Hedgehog信號通路。Sonic Hedgehog存在于70%的胰腺癌中，與胰腺癌關(guān)系密切[6]，但在胰腺癌干細胞中的研究國內(nèi)外甚少。我們前期研究[4]成功采用懸浮法培養(yǎng)PANC1干細胞，并通過體內(nèi)外實驗證實其具有腫瘤干細胞樣特性，在此基礎(chǔ)上采用實時 RT-PCR法檢測PANC1干細胞Smo和Gli1 mRNA表達，證實了PANC1干細胞存在Sonic Hedgehog信號通路。

增殖能力是腫瘤干細胞自我更新能力的表現(xiàn)之一。本實驗中，PANC1干細胞經(jīng)10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后，增殖能力明顯下降，這與Peacock等[7]用環(huán)巴明處理膠質(zhì)瘤干細胞和骨髓瘤干細胞的結(jié)果相符。腫瘤干細胞是一種慢周期細胞[8]，細胞中以G0/G1期為主。本實驗結(jié)果顯示，環(huán)巴明處理前，PANC1干細胞以G0/G1期為主，經(jīng)10 μmol/L 環(huán)巴明處理72 h后，PANC1干細胞G0/G1期比例明顯下降，自我更新能力明顯抑制，但細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示環(huán)巴明阻斷Hedgehog信號通路抑制胰腺癌干細胞的自我更新并非通過影響細胞凋亡實現(xiàn)，其具體機制有待進一步探討。

[1] Bar EE,Chaudhry A,Lin A,et al.Cyclopamine-mediated Hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.Stem Cells,2007,25:2524-2533.

[2] Zhao C,Chen A,Jamieson CH,et al.Hedgehog signaling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia. Nature, 2009, 458:776-779.

[3] 黃鳳婷，張世能，黃奕俊，等.人胰腺癌細胞系SW1990中腫瘤干細胞樣側(cè)群細胞的分離及生物學(xué)特性研究.中華胰腺病雜志,2008,8:372-375.

[4] 張世能,峗淑莉,黃鳳婷,等.胰腺癌腫瘤干細胞的懸浮培養(yǎng)法.中華胰腺病雜志,2009,9:315-317.

[5] Liu S,Dontu G,Mantle ID,et al.Hedgehog signaling and bmi-1 regulate self-renewal of normal and malignant human mammary stem cells.Cancer Res,2006,66:6063-6071.

[6] Feldmann G,Dhara S,Fendrich V,et al.Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancer invasion and metastases:a new paradigm for combination therapy in solid cancers.Cancer Res,2007,67:2187-2196.

[7] Peacock CD,Wang Q,Gesell GS,et al.Hedgehog signaling maintains a tumor stem cell compartment in multiple myeloma.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:4048-4053.

[8] Guan Y,Gerhard B,Hogge DE.Detection,isolation,and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).Blood,2003,101:3142-3149.

2010-04-07)

(本文編輯：呂芳萍)

Effectsonselfrenewalofpancreaticcancerstemcellsbyinhibitinghedgehogsignalpathway

HUANGFeng-ting,ZHANGShi-neng,LIANGAi-xin,WEIShu-li,ZHUANGXiao-hong,CHENWen-bo.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

ZHANGShi-neng,Email:shinengz2010@163.com

ObjectiveTo investigate the effects on self-renewal of pancreatic cancer stem cells by inhibiting hedgehog signaling pathway through cyclopamine.MethodsPANC1 stem cells, PANC1 adherent cells and immortalized pancreatic ductal epithelial H6C7 cells were treated with 0.5, 1, 2, 5, 10 mol/L of cyclopamine for 24, 48, 72 h. The expression of Smo mRNA and Gli1 mRNA were detected by real-time PCR. Cell growth viability was measured by CCK 8. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsSeventy-two hours after cyclopamine treatment, the Smo mRNA expressions of PANC1 stem cells, PANC1 adherent cells and H6C7 cells were 1,0.83 and 2.61; the expressions of Gli mRNA were 57.27,26.35,1; the inhibitory rates were (37.85±13.69)%, (8.53±4.43)%, (43.55±28.98)%. Compared with PANC1, the expressions of Smo mRNA, Gli1 mRNA and the inhibitory rate of PANC1 stem cells significantly increased (P<0.05). The proportion of G1stage of PANC1 stem cells significantly decreased from (67.41±6.35)% to (36.53±6.03)% (P<0.05), and the apoptosis decreased from (10.95±5.68)% to (5.73±1.42)% (P>0.05). The proportion of G1stage of PANC1 cells significantly decreased from (67.64 ± 6.88)% to (53.13±1.10)%(P<0.05); the apoptosis decreased

from (12.08±4.12)% to (5.66±1.33)%(P>0.05). While both the proportion of G1stage and apoptosis of H6C7 cells was not significantly different.ConclusionsCyclopamine can inhibit the proliferation of PANC1 stem cells via blocking hedgehog signal pathway, and the mechanism may not be associated with cell apoptosis.

Pancreatic neoplasm； Stem cells； Hedgehog signal pathway； Self-renewal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.005

廣東省自然科學(xué)基金(8151008901000139)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2009066)

510120 廣州，中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科

黃鳳婷，Email：rachelh1982@163.com

張世能，Email：shinengz2010@163.com