李市場 劉紅霞 朱朝陽 王冬冬

(河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471003)

低能離子注入油脂高產菌株黏紅酵母(RHODOTORULA GLUTINIS)的選育

李市場 劉紅霞 朱朝陽 王冬冬

(河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471003)

本文對油脂高產菌株選育過程中的篩選方法進行研究，采用蘇丹黑B染色作為定性分析、酸熱耦合超聲波作為定量分析高產油脂菌株的篩選方法，通過低能離子注入黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)進行誘變，篩選油脂高產菌株。結果表明:獲得了一株油脂高產菌株D30，產量比出發(fā)菌株提高33.05%，傳代試驗表明了D30的遺傳穩(wěn)定性良好，當發(fā)酵96 h，其油脂產量達3.10 g/L。另外，對D30發(fā)酵動力學進行了研究，當發(fā)酵時間為10 d時，其生物量為47.98 g/L(菌體濕重)，油脂產量達到7.81 g/L。

黏紅酵母 油脂 蘇丹黑B染色 索氏抽提法 酸熱耦合超聲波

微生物油脂(microbial oil)又稱單細胞油脂(single cell oil.SCO)，即微生物(酵母、霉菌、細菌等)在一定條件下，以碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳、氮源，輔以無機鹽生產的油脂和另一些有商品價值的脂質［1］。微生物油脂的研究和開發(fā)，不僅豐富了傳統(tǒng)的油脂工業(yè)技術，而且是工業(yè)化生產油脂的一個重要途徑。尤其是目前人口的快速增長，使得油脂需求量與自然資源嚴重短缺的矛盾日益尖銳，在此情況下，開辟新油源——微生物油脂更具有重要的理論和實際意義。

目前對微生物油脂的研究和開發(fā)主要集中在利用微生物生產高附加值的特殊用途功能性油脂方面。利用微生物可生產含各種類型脂肪酸油脂，有單不飽和脂肪酸，如棕櫚油酸、油酸等;多不飽和脂肪酸，如亞油酸(LA)、亞麻酸(LNA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等;這些具有特殊功能和用途的功能性油脂在促進人類健康方面具有越來越重要的作用［2－3］。

微生物油脂具有很多優(yōu)點，如微生物細胞增殖快，生產周期短，價值便宜，不受季節(jié)、氣候變化的限制等。但是，微生物油脂也有其局限性，最明顯的一點就是油脂的產量低。為了提高產量，本文利用低能離子注入選育高產油脂菌株。低能離子生物學是一門新興邊緣交叉學科，它集能量沉積、動量傳遞、質量沉積及電荷交換等效應［4］，同時還具有高傳能線密度值、集束性好、射程可控、能量沉積和質量沉積區(qū)域集中等特點，因此可以在損傷輕的情況下，獲得更高的突變率和更寬的突變譜［5］。最近幾年，低能離子生物學研究在農作物育種方面取得可喜的成果。陳宇等［6］用N+注入產紅霉素菌，使紅霉素的產量提高了20%以上。王紀等［7］用低能離子注入生產VD的麥角甾醇酵母，發(fā)酵水平提高了50%以上，而且遺傳穩(wěn)定。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器

LZD 900低能離子注入設備:中科院等離子物理研究所自主開發(fā);LDZX－50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;BS223S電子天平(Max=220 g，d=0.001 g):北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HH－S恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市江通電子有限公司;TDL－50電動離心機:江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;SW－CJ－1F型單人雙面凈化工作臺:蘇州凈化設備有限公司;HY－8數顯大容量振蕩器(搖床):江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;ECLIPSE TS100－F倒置顯微鏡:NIKON。

1.2 菌種

黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)31596:中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:加入2%瓊脂和2%蛋白胨的10%麥芽汁，pH:5.8 ～ 6.2。

種子培養(yǎng)基:加入2%蛋白胨的10%麥芽汁，pH:5.8 ～ 6.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖:80;蛋白胨:1.8;(NH4)2SO4:1.11;KH2PO4:2.5;pH:5.8 ～ 6.2。

每個三角瓶加CaCO30.5 g單獨滅菌，采用濕熱滅菌法:115 ℃保溫30 min，pH:5.8 ～ 6.2。

1.4 培養(yǎng)工藝

斜面培養(yǎng):轉接斜面后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，4℃保藏;

種子培養(yǎng):從斜面刮取3環(huán)菌體，接種于種子培養(yǎng)基中(250 mL三角燒瓶裝液30 mL)，28℃搖床轉速為190 r/min培養(yǎng)20 h。

發(fā)酵培養(yǎng):按10%(體積比)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量為250 mL三角瓶裝液30 mL)，28℃搖床轉速為190 r/min培養(yǎng)96 h。

1.5 離子注入

1.5.1 菌懸液的制備

用適量的無菌水洗脫純種黏紅酵母斜面，利用梯度稀釋法，稀釋至一定的倍數，制成106cfu/mL的菌懸液。

1.5.2 離子束輻照設備

離子注入機是由中國科學院離子束生物工程重點實驗室研究制備的LZD 900多功能離子注入機。本試驗用10 keV的氮離子(N+)進行不同劑量的離子注入。靶室真空度為10－3Pa，以5 s脈沖式注入，間隔15 s。

1.5.3 離子注入處理

取0.1 mL已稀釋到合適濃度的菌懸液均勻涂布于無菌平皿上，無菌風干后進行注入。在注入機上，能量選用 10 keV，以不同的劑量(20、40、60、80、100、120)×2.6×1013ions/cm2對黏紅酵母單菌落進行注入;注入靶室的真空密度為10－3Pa。該試驗把真空未接受離子注入的處理作為真空對照(設置放入真空靶室，以不經離子注入的樣品為真空對照，以同樣方法涂平皿，風干后不置于真空下的樣品為基本對照)。

1.5.4 離子注入后的培養(yǎng)

離子注入后立即在超凈工作臺上用新鮮無菌水洗脫，進行適當的稀釋，并涂布于分離平皿上，在28℃培養(yǎng)數小時，長出單菌落，計數并計算出相對存活率和突變率。

1.5.5 存活率的計算

在不同的誘變劑量下，接受離子注入誘變的菌株的存活單菌落數與不接受注入的對照菌株的存活單菌落數，兩者的比值即為存活率。存活率=各處理計量的單菌落數/真空對照單菌落數×100%。

1.5.6 突變率的計算

挑選單菌落轉接斜面，根據上述培養(yǎng)條件，進行搖瓶培養(yǎng)，同時以出發(fā)菌作為對照，考察菌株的產油脂能力。在誘變選育研究中，負突變率是指負突變菌株占全部被考察的菌株的比率，正突變率指正突變菌株占全部被考察菌株的比率。

1.5.7 篩選方法

1.5.7.1 蘇丹黑 B 染色

蘇丹黑B(蘇丹黑B:0.3 g，70%乙醇100 mL)是一種能溶于脂肪的色素，而微生物油脂不被一般染料著色，但可被脂溶性染料如蘇丹黑B著色，使脂肪粒呈現(xiàn)藍黑色，從而可以定性判斷油脂的含量［8］。

染色方法:

在潔凈無油的載玻片中央加1滴培養(yǎng)好的發(fā)酵液，熱固定，用蘇丹黑B染色染色10 ～15 min，傾去染料，用濾紙吸干后用二甲苯清洗涂片，直至洗脫液無色為止。用0.5%番紅水溶液復染1～2 min，水洗后吸干、鏡檢，細胞和菌絲呈紅色，菌體內的脂肪顆粒呈藍黑色［9］。

1.5.7.2 索氏抽提法

微生物油脂是脂類物質，能溶于乙醚等有機溶劑。利用微生物油脂能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將其提取出來。整個提取過程均在索氏提取器中進行，使用的脂溶性溶劑為乙醚［10］。

樣品的準備:將誘變后的菌株按上述培養(yǎng)條件搖瓶培養(yǎng)96 h后，離心收集菌體，濕菌體在80～100℃電熱鼓風干燥箱內烘干至恒重，取1張濾紙，做成濾紙斗，烘干后在電子天平上稱重，然后將碾碎干菌體裝在濾紙斗里稱重，兩質量之差即為干菌體的質量。

油脂的提取:把裝有樣品的濾紙斗放入提取管內，向提取管中緩緩倒入乙醚直至液面達到虹吸管上彎頭部，正好虹吸1次;再向提取管中倒入乙醚，使其液面達到第1次液面的一半。將索氏提取儀整個裝置放入恒溫水浴鍋中加熱提取(水溫65℃左右)，提取24 h以上。

提取終點的判斷:可將被回流的乙醚滴在濾紙上乙醚揮干后有無油跡來判斷，無油跡證明脂肪已被抽提完全。

油重的確定:稱取一個烘干至恒重的三角瓶，記做W1，將接收瓶中的液體轉移至三角瓶中，乙醚完全揮凈后，將三角瓶瓶放入烘箱中(100±5)℃烘干至恒重。烘干后易吸濕，因此稱量要迅速，記做W2，油重W=W2－W1

1.5.7.3 酸熱耦合超聲波法

由于黏紅酵母所產生的油脂屬于胞內物質，要提取出油脂必須要對細胞進行破碎。酸熱耦合超聲波法的原理是:主要是利用鹽酸對細胞壁中糖及蛋白質等成分的作用，對菌體細胞壁進行破壁處理，使原來結構緊密的細胞壁變得疏松，再經沸水浴及速凍處理使細胞壁進一步被破壞，然后用有機溶劑浸提細胞中的油脂［11－12］。

菌體的收集:將發(fā)酵液倒入50 mL的離心管中，4 000 r/min離心20 min，棄上清液，加入蒸餾水10 mL，攪拌均勻，4 000 r/min離心20 min，重復2次。

細胞破碎:向收集好的菌體加入10 mL 4 mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫放置30 min后，沸水浴5 min，－20℃速冷10 min;然后使用超聲波細胞破碎儀進一步破碎細胞，超聲功率200 W，全程時間5 min，超聲時間3 s，間歇時間4 s。

油脂的提取:破碎后的菌體懸液，加入2倍體積氯仿:甲醇(2∶1)提取液，充分振蕩后，4 000 r/min離心25 min，取氯仿層，加等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 000 r/min離心25 min，取氯仿層，揮發(fā)除去氯仿即得油脂。

2 結果與分析

2.1 離子注入

黏紅酵母經過離子注入后，存活率和突變率如圖1、圖2所示。結果表明，存活曲線呈現(xiàn)先降后升的“波浪型”曲線。首先，存活率大幅度下降;在(20～60)×2.6×1013ions/cm2之間，存活率的下降趨于緩慢;在(60～80)×2.6×1013ions/cm2之間，存活率又有了小幅度的上升;當劑量大于80×2.6×1013ions/cm2時，存活率又開始下降。這種特異的存活曲線與傳統(tǒng)的物理誘變或者化學誘變所呈現(xiàn)“肩型”或“直線型”的存活曲線相比有明顯不同［13］，其原因為離子注入除了具有能量沉積效應外，還有動量傳遞、質量沉積和電荷中和與交換等效應存在［14］。

突變株油脂產量相比出發(fā)菌株，產量低于出發(fā)菌株5%的視為負突變菌株;產量高于出發(fā)菌株5%的視為正突變菌株，在正負5%之間的為未突變。各劑量處理下的存活率和突變率為3次以上重復的平均值。由圖 2可知，在(20、40、60)×2.6×1013ions/cm2的注入劑量下，負突變率要高于正突變率;在(80、100、120)×2.6 ×1013ions/cm2，正突變率要遠比負突變率高，尤其是(80、100)×2.6 ×1013ions/cm2。因此，當注入能量為10 keV時，在既考慮到致死率，又考慮到正突變率情況下，注入劑量選擇(80、100)×2.6×1013ions/cm2作為該菌株常用的離子注入參數。

2.2 篩選方法的比較。

經蘇丹黑B染色法染色后，菌體內的脂肪粒呈現(xiàn)黑色，而菌體為紅色，根據脂肪粒的大小可初步判斷油脂含量的多少。通過蘇丹黑B染色，經顯微鏡觀察，定性篩選出5株較高產菌株，分別為:D30、B23、B13、C53、C32 如圖3 所示。

圖3 蘇丹黑B染色法得到的5株油脂高產菌株

由圖3可以看出，脂肪粒的大小順序排列為:D30＞B23＞B13＞C53＞C32，根據蘇丹黑B染色的原理，產油脂能力和脂肪粒的大小正相關，這5株黏紅酵母產油脂的能力大小也應該為:D30＞B23＞B13＞C53＞C32。為了驗證初篩過程的準確性，分別用索氏抽提法和酸熱耦合超聲波法對這5株高產菌株進行定量分析，結果見表1。

表1 酸熱耦合超聲波提取法和索氏抽提法對油重的影響 /g/L

由表1可以看出，兩種定量分析均驗證了所得油脂得率的高低與初篩中脂肪粒的大小相對應，油脂含量最高菌株為D30，這說明初篩方法準確而有效。

蘇丹黑B染色對黏紅酵母油脂進行定性觀察簡單快捷，不需要通過物理或者化學方法破碎細胞壁和進行常規(guī)的有機溶劑對油脂提取，能在短時間內從大量的誘變菌株中快速定性的篩選出高產菌株。

蘇丹黑B染色法只能定性地觀察菌株的產油脂能力，不能定量地檢測油脂的含量。酸熱耦合超聲波法與索氏抽提法［15］相比，其操作簡便、快速，樣品需要量小并且不需任何處理，可作為定量檢測的方法用于復篩。

因此，在后續(xù)的研究中，選用蘇丹黑B染色法作為定性分析方法、酸熱耦合超聲波法作為定量檢測方法，篩選出一株高產油脂黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)D30，發(fā)酵 96 h，產量高達 3.10 g/L，比出發(fā)菌株提高了33.05%(出發(fā)菌株為2.33 g/L)

2.3 菌種D30遺傳穩(wěn)定性試驗。

為了確保篩選到的高產突變菌株的遺產穩(wěn)定性，對誘變選育菌株D30進行傳代試驗，每代試驗過程為:高產菌株自然分離→單菌落→斜面→種子瓶→搖瓶發(fā)酵，提取油脂產量。共傳6代，每代均做3個平行樣，結果見表2。由表2可以看出，從F1～F6代，油脂產量基本上維持在3.20 g/L左右，最高可達3.55 g/L，說明該菌株遺產穩(wěn)定性較好。

表2 高產突變株遺傳穩(wěn)定性試驗

2.4 高產突變株D30的發(fā)酵動力學分析

將經過誘變選育出的高產油脂菌株D30在上述培養(yǎng)條件下進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次，并取樣檢測繪制發(fā)酵曲線(每次試驗抽取3個平行樣品)，結果見圖4。

圖4 D30的發(fā)酵曲線

由圖4可以看出，由于發(fā)酵液中加入了適量的CaCO3用來平衡pH，整個培養(yǎng)過程中pH值基本穩(wěn)定在5.8～6.2之間，而此pH正是黏紅酵母菌株生長及合成油脂的最佳范圍［16］。油脂的生產隨著菌體的生長不斷積累。1～2 d為其短暫的滯后期，很快進入快速生長期，油脂的積累與葡萄糖的消耗呈負相關性，2～6 d時，生物量快速的增加，此時為菌體生長階段，6 d后菌體的增長進入穩(wěn)定期，油脂開始大量的積累，耗糖速度也明顯加速。在10 d時，菌體量和油脂產量達到最高，糖濃度已經降到最低，此時達到發(fā)酵終點，生物量為47.98 g/L(菌體濕重)，油脂產量達到7.81 g/L。在發(fā)酵到10～11 d的時候，pH開始下降，油脂的產量和菌體生物量也開始下降，推測其原因可能為菌體開始自溶，葡萄糖即將耗盡，油脂被當做碳源重新利用。

3 結論

采用低能離子注入技術誘變黏紅酵母，選育油脂高產菌株，篩選出一株高產突變株D30，其油脂產量達到3.10 g/L，比出發(fā)菌株提高了33.05%。確立了蘇丹黑B染色法作為快速定性、酸熱耦合超聲波法作為定量篩選高產油脂菌株的方法;D30的發(fā)酵動力學研究表明，到達到發(fā)酵終點時，其生物量為47.98 g/L(菌體濕重)，油脂產量達到 7.81 g/L。

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Screening of Lipid－producing Strain Rhodotorula Glutinis by Low－energy Ion Implantation

Li Shichang Liu Hongxia Zhu Chaoyang Wang Dongdong
(Food and Bioengineering School，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003)

The paper studied the screening of strain with high － yield oil，and Sudan Black B staining and Acid－h(huán)eating+Ultrasonic extraction were respectively chosen in qualitative and quantitative analysis methods to screen the strain with high－yield oil.Screening of lipid－producing strain Rhodotorula glutinis by low －energy ion implantation was studied as well.As a result，a high － yield mutant strain D30 was obtained，and it's lipid yield was increased by 33.05%than that of original.And it was found that genetic characteristics of D30 was rather stable through successive transfer of cultures，when fermentation time was 96 h and it's lipid yield increased to 3.10 g/L.Additionally，the fermentation characteristic of high－yield mutation strain D30 was studied，it's lipid yield and biomass respectively increased to 7.81 g/L and 47.98 g/L(wet strain)，when fermentation time reached 10 d.

Rhodotorula glutinis，lipid，Sudan Black B staining，Soxhlet extraction，Acid － heating+Ultrasonic extraction

Q939.97

A

1003－0174(2011)08－0031－05

中國科學院等離子體物理研究所暨安徽省離子束生物工程學重點實驗室開放基金(2008B004)

2010－10－28

李市場，男，1976年出生，博士，副教授，碩士生導師，微生物育種