焦俊霞， 高維娟， 李玉明， 錢(qián) 濤， 周曉春， 朱炎杰， 董雅潔

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000;2河北省化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，3河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050026)

黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達(dá)的影響*

焦俊霞1， 高維娟2△， 李玉明1， 錢(qián) 濤3， 周曉春1， 朱炎杰1， 董雅潔1

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000;2河北省化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，3河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050026)

目的： 觀察黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表達(dá)的影響。方法取原代培養(yǎng)8 d的大鼠海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組)、溶劑對(duì)照組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖+黃芪注射液溶劑處理組)和黃芪注射液處理組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖+黃芪注射液處理組)。除正常對(duì)照組外，各組均進(jìn)行缺糖缺氧0.5 h，再分別于復(fù)氧復(fù)糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h采用Western blotting法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)海馬神經(jīng)元bcl-2和bax mRNA的表達(dá)。結(jié)果Western blotting結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比，模型組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)明顯升高，而B(niǎo)cl-2/Bax比值下調(diào)(Plt;0.05)；與模型組比，黃芪注射液處理組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值升高(Plt;0.05)，而溶劑對(duì)照組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值則無(wú)顯著變化(Pgt;0.05)。bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)趨勢(shì)同蛋白。結(jié)論黃芪注射液可提高缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值，抑制Bax表達(dá)，從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡。

缺氧缺糖/復(fù)氧； 黃芪注射液； Bcl-2; Bax； 海馬神經(jīng)元； 細(xì)胞凋亡。

缺血性腦血管病是目前神經(jīng)內(nèi)科最常見(jiàn)的一種疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康,致殘率非常高,病理機(jī)制也十分復(fù)雜,因此對(duì)其病理過(guò)程中基因表達(dá)變化和藥物干預(yù)作用的研究倍受人們關(guān)注。對(duì)這種疾病的治療一般是以疏通堵塞的血管改善病變部位的血液供應(yīng)為主，而當(dāng)缺血部位的血液供應(yīng)好轉(zhuǎn)以后就容易發(fā)生更加嚴(yán)重的再灌注損傷，其中細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要的作用。黃芪注射液為臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[1]。本研究通過(guò)觀察黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-assaciated X protein,Bax)表達(dá)的影響，探討黃芪注射液抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 1-2 d SPF級(jí)SD大鼠,雌雄兼有,由天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供,許可證號(hào)為SCXK(津)2009-001。

1.2試劑和儀器 兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德公司；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購(gòu)于Chemicon；小鼠抗大鼠Bax單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海申能博彩生物公司;bax和bcl-2引物是由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)；RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;多聚賴氨酸和阿糖胞苷購(gòu)自Sigma;胎牛血清和馬血清由Hyclone生產(chǎn);谷氨酰胺和胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工程公司;DMEM/F12培養(yǎng)基和B27由Gibco生產(chǎn);SP免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn);其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器: HERA cell 150型CO2培養(yǎng)箱由Heraeus生產(chǎn);Leica DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡由Wetzlar GmbH生產(chǎn);TDL-40B離心機(jī)由上海安亭科學(xué)儀器制造廠生產(chǎn);DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠;MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自上海雷勃公司。

2方法

2.1海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 取新生24 h的乳鼠放進(jìn)冰浴的75％乙醇內(nèi)浸泡1 min消毒并窒息，用眼科顯微鑷夾取海馬組織，在解剖顯微鏡下去除含有血管的軟腦膜(以上操作均在冰上進(jìn)行)，沉淀后吸去上層D-Hanks液，放入0.125％胰蛋白酶消化10-15 min，同時(shí)用眼科剪剪切海馬組織至1 mm×1 mm×1 mm大小，用馬血清(0.125％胰蛋白酶量的10％)終止消化，把組織塊混合液移入離心管，1 000 r/min離心5 min×3次，去上清后加DMEM/F12溶液5 mL，吹打離散組織，制成細(xì)胞懸液，200目濾網(wǎng)過(guò)濾。取10 μL細(xì)胞懸液加在計(jì)數(shù)板上，倒置顯微鏡下計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，以5×108cells/L密度接種在培養(yǎng)瓶，提取蛋白用于Western blotting; 以5×108cells/L密度接種在直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，提取總mRNA,用于RT-PCR。種植液成分為80％DMEM/F12、10％胎牛血清、10％馬血清、1％谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素各1％。將培養(yǎng)皿放入37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2 d用無(wú)血清培養(yǎng)液代替種植液，培養(yǎng)液成分為95％DMEM/F12、2％B27、1％谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素各1％。第4 d把一半培養(yǎng)液換成新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液，并按全液量添加0.5％阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，24 h后替換成新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)8 d后建立海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型，并檢測(cè)指標(biāo)。

2.2海馬神經(jīng)元純度鑒定 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)海馬神經(jīng)元純度：采用SP法檢測(cè)NSE表達(dá),具體操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。兔抗大鼠NSE多克隆抗體按1∶50稀釋；PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿和突起呈棕黃色，胞核有少許黃色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)非連續(xù)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之和，每組重復(fù)5次。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對(duì)免疫組化陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2.3缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組 把原代培養(yǎng)8 d 的大鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為4 組:正常對(duì)照組、模型組、黃芪注射液處理組和溶劑對(duì)照組。除正常對(duì)照組外均參照Bossenmeyer等[2]的方法建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型:用無(wú)糖Earle’s液代替培養(yǎng)液，隨即把培養(yǎng)皿(瓶)置于37 ℃、CO2溫箱中的缺氧裝置里，快速通入高純氮?dú)? min，再使氣體勻速緩慢連續(xù)排出。缺氧缺糖30 min后，換正常無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)在37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。黃芪注射液處理組于缺氧缺糖時(shí)加入黃芪注射液[0.5 g(生藥)·L-1][3]，直至培養(yǎng)結(jié)束；溶劑對(duì)照組處理方法與黃芪注射液處理組相同，只是將黃芪注射液換為pH值7.4 的等量無(wú)菌去離子水；模型組在缺氧缺糖時(shí)加入與正常培養(yǎng)液等量的Earle′s液，缺氧缺糖后正常培養(yǎng)。各組在復(fù)氧復(fù)糖后0、0.5、2、6、24、72 和120 h觀察Bcl-2、Bax蛋白及其mRNA的表達(dá)。

2.4蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，提取胞質(zhì)蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取70 μg樣品，加入蛋白體積1/4的loading buffer混勻，在100 ℃沸水中煮10 min，以12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.5％奶粉封閉過(guò)夜后加入用封閉液稀釋的兔抗Bcl-2多克隆抗體(1∶1 500稀釋)和小鼠抗Bax單克隆抗體(1∶300稀釋)，4 ℃過(guò)夜。用生物素標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000稀釋) 孵育1 h，洗膜液洗后用化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用Quantity One軟件對(duì)各時(shí)點(diǎn)蛋白條帶平均吸光度值進(jìn)行分析。

2.5RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)bcl-2和bax mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞，用Trizol一步法提取RNA，按TaKaRa RNA PCR kit(AMV) 說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參照β-actin上游引物5’-CAT CCTGCGTCTGGACCT-3’,下游引物5’-TCAGGAGGAGCA ATGATCTTG-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為480 bp。按照PCR amplification kit 說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min，循環(huán)35次，目的條帶在480 bp。bcl-2上游引物5’-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3’,下游引物5’-GCTGATTTGACCATTTGCCTGA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為328 bp;按照PCR amplification kit 說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min，72 ℃延伸3 min，循環(huán)35次，目的條帶在328 bp。bax cDNA上游引物5’-GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT-3’,下游引物5’-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC-3’，按照PCR amplification kit 說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 4min，循環(huán)35次;最后于72 ℃延伸3 min，目的條帶在357 bp。用2％ 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity One進(jìn)行定量分析，并計(jì)算目的基因/β-actin吸光度(A)的比值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)純度鑒定

細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示:無(wú)血清培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元胞體飽滿，突起明顯,突起末端分支形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，相互支持生長(zhǎng)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞少見(jiàn)，5個(gè)400倍視野中陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目為775個(gè)，純度為(92.35±0.72)％，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of NSE protein in cultured rat hippocampal neurons.A:negative;B:NSE.

2黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Western bloting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 與正常對(duì)照組比，模型組120 h Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別，余各時(shí)點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(Plt;0.05)，復(fù)氧復(fù)糖0.5 h開(kāi)始升高、2 h達(dá)高峰、之后逐漸下降，仍高于正常組。與模型組比，黃芪注射液處理組除外120 h，余各時(shí)點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯增高(Plt;0.05)。與正常對(duì)照組比，模型組120 h Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別，余各時(shí)點(diǎn)Bax蛋白表達(dá)明顯升高(Plt;0.05)，復(fù)氧復(fù)糖0.5 h開(kāi)始升高、6 h達(dá)高峰、之后逐漸下降，仍高于正常(Plt;0.05)。與模型組比，黃芪注射液處理組120 h Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別，而余各時(shí)點(diǎn)Bax蛋白表達(dá)均明顯降低(Plt;0.05)。溶劑對(duì)照組Bcl-2和Bax蛋白變化趨勢(shì)與模型組變化相一致(Pgt;0.05)。與正常對(duì)照組比，模型組Bcl-2/Bax比值明顯下調(diào)(Plt;0.05)；與模型組比，黃芪注射液處理組Bcl-2/Bax比值明顯升高(Plt;0.05)，而溶劑對(duì)照組無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖2-4。

3黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元bcl-2和baxmRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示,bcl-2和bax mRNA表達(dá)趨勢(shì)同蛋白表達(dá)趨勢(shì)相一致，見(jiàn)圖6-8。

Figure 2.The effect of Astragalus injection on expression of Bcl-2 and Bax protein after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.A:normal control group;B:model group;C:vehicle control group; D:Astragalus injection treatment group.

Figure 3.The effect of Astragalus injection on the expression of Bcl-2 protein after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 4.The effect of Astragalus injection on expression of Bax protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats±s.n= 5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 5.The effect of Astragalus injection on the ratio of Bcl-2/Bax after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n= 5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle group.

討 論

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病,其致死率、致殘率均高,缺血造成腦組織損傷,再灌注使可逆性缺血損傷加重,并通過(guò)各種反應(yīng)將可逆性損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。大腦是對(duì)缺血缺氧十分敏感的組織，而海馬則是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)缺氧耐受相對(duì)較差的部位。研究表明[3],神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后常常發(fā)生細(xì)胞凋亡。海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡是受各種基因調(diào)控的程序化死亡過(guò)程，其病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，其中,線粒體通路是最普遍的凋亡機(jī)制和細(xì)胞凋亡核心。另外，研究表明[4]，線粒體通路主要受bcl-2基因家族調(diào)控，其中bcl-2和bax是一對(duì)在功能上相互對(duì)立的凋亡調(diào)控基因，腦缺血再灌注損傷與凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax密切相關(guān)。bcl-2是抗凋亡基因,可阻止許多因素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而bax是促凋亡基因，二者的比例是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的重要調(diào)控因素[5]。Bax蛋白不但拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。實(shí)驗(yàn)表明，Bcl-2家族成員通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性和完整性起重要調(diào)控作用[6]。Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，調(diào)控凋亡誘導(dǎo)蛋白的釋放和線粒體功能，兩者間的平衡影響凋亡的發(fā)生[5]。定位于線粒體外膜的Bcl-2可能是線粒體PT孔道的組成成份,能調(diào)節(jié)線粒體膜對(duì)一些凋亡蛋白前體的通透性。線粒體外膜上的Bax能允許一些離子和小分子物質(zhì)(細(xì)胞色素C等)穿過(guò)線粒體膜,進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡；Bcl-2還能將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用。在細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白是以異二聚體的形式存在，阻止Bax插入線粒體外膜，保護(hù)線粒體電勢(shì)梯度，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)來(lái)抑制凋亡。如果Bcl-2和Bax的表達(dá)量相互平衡，形成的Bcl-2/Bax異二聚體占優(yōu)勢(shì)，則細(xì)胞的存活期正常；如果Bcl-2過(guò)表達(dá)而B(niǎo)ax的表達(dá)不相應(yīng)增多，使形成的Bcl-2/Bcl-2同二聚體占優(yōu)勢(shì)，則細(xì)胞的存活期延長(zhǎng)；如Bax過(guò)表達(dá)而B(niǎo)cl-2不相應(yīng)增多，使形成的Bax/Bax同二聚體占優(yōu)勢(shì),則發(fā)生細(xì)胞凋亡[7]。

Figure 6.The effect of Astragalus injection on expression of bcl-2 and bax mRNA after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.A:model group;B: vehicle control group;C:Astragalus injection treatment group.

Figure 7.The effect of Astragalus injection on expression of bcl-2 mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 8.The effect of Astragalus injection on expression of bax mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle control group.

Figure 9.The effect of Astragalus injection on the ratio of bcl-2/bax after hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.±s.n= 5.*Plt;0.05 vs normal control group; #Plt;0.05 vs model group and vehicle group.

中醫(yī)藥對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡干預(yù)作用的研究倍受人們關(guān)注。其中，黃芪具有補(bǔ)氣生陽(yáng)、益氣固表、抗毒生肌之功能。藥理學(xué)研究表明，黃芪成分復(fù)雜，生理活性多種多樣。黃芪能明顯提高腦缺血/再灌注鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶和一氧化氮含量，清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注，從而有效對(duì)抗腦缺血/再灌注損傷[8]。以黃芪的提取液為主要成分的現(xiàn)代中藥制劑黃芪注射液，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕之功。黃芪注射液每1 mL相當(dāng)于生藥2 g，葉冬青等[9]的研究證明黃芪注射液對(duì)體外培養(yǎng)的缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。張雅麗等[3]黃芪注射液可以抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,提高細(xì)胞的活性,對(duì)缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞施加缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖因素來(lái)模擬腦缺血/再灌注病理生理過(guò)程，建立腦缺血/再灌注的細(xì)胞模型，觀察黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。研究證實(shí)，模型組和黃芪注射液溶劑對(duì)照組海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)顯著高于正常組，且Bcl-2在復(fù)氧復(fù)糖后2 h表達(dá)達(dá)高峰，而B(niǎo)ax在復(fù)氧復(fù)糖后6 h表達(dá)達(dá)高峰；與模型組比，黃芪注射液組各時(shí)點(diǎn)Bcl-2表達(dá)顯著增加，而B(niǎo)ax表達(dá)顯著降低。本實(shí)驗(yàn)表明，海馬神經(jīng)元在缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖Bcl-2隨細(xì)胞凋亡信號(hào)的啟動(dòng)而開(kāi)始升高,與Bax結(jié)合成Bcl-2/Bax異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡；而腦缺血再灌注損傷后Bax在細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后表達(dá)增加,發(fā)揮進(jìn)一步凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程，故在模型組顯著升高。黃芪注射液顯著上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，發(fā)揮明顯的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后120 h Bcl-2和Bax的表達(dá)與正常組相比差異無(wú)顯著，推測(cè)可能是與磷酸化的Bcl-2和Bax半衰期密切相關(guān)[10]，復(fù)氧復(fù)糖72 h后高表達(dá)的Bcl-2和Bax蛋白開(kāi)始大量降解，復(fù)氧復(fù)糖后120 h表達(dá)趨近正常，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，大鼠海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后有明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而黃芪注射液有明顯的抗凋亡作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)促凋亡基因bax水平，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2水平，提高Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

[1]劉廣義，付志新，郝娟芝，等.大鼠腦缺血再灌流后Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平表達(dá)與大腦皮層及紋狀體區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的影響[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2004,4(4):252-525.

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AstragalusinjectionaffectsexpressionofBcl-2andBaxafterhypoxia/hypoglycemiaandreoxygenationinrathippocampalneurons

JIAO Jun-xia1,GAO Wei-juan2,LI Yu-ming1,QIAN Tao3,ZHOU Xiao-chun1,ZHU Yan-jie1,DONG Ya-jie1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiChemicalamp;PharmaceuticalCollege,3HebeiProvincialHospital,Shijiazhuang050026,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragalusinjection on the expression of Bcl-2 and Bax after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in rat hippocampal neurons.METHODSThe hippocampal neurons cultured for 8 days were divided into 4 groups: normal control group,model group (hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation group),vehicle control group (hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation+Astragalusvehicles control group),andAstragalusinjection treatment group (hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation+Astragalusinjection treatment group).The rats in model group,Astragalusinjection treatment group and vehicle control group were deprived of oxygen and glucose for 30 min.The methods of Western blotting and RT-PCR were used to measure the expression of Bcl-2 and Bax at mRNA and protein levels after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation for 0 h,0.5 h,2 h,6 h,24 h,72 h and 120 h.RESULTSCompared to normal control group,the protein expression of Bcl-2 and Bax increased obviously and the ratio of Bcl-2/Bax decreased in model group (Plt;0.05).Compared to model group,the protein expression of Bcl-2 and Bax at each time point in vehicle control group had no obvious change (Pgt;0.05).However,the protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax increased obviously,but the protein expression of Bax decreased obviously (Plt;0.05) inAstragalusinjection treatment group.The expression of bcl-2 and bax mRNA showed the same tendency as the proteins changed.CONCLUSIONAstragalusinjection inhibits the expression of Bax and increases the expression of Bcl-2,thus regulating the ratio of Bcl-2/Bax after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation and inhibiting the process of apoptosis in hippocampal neurons.

Hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation;Astragalusinjection; Bcl-2; Bax; Hippocampal neurons; Apoptosis

1000-4718(2011)05-0905-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.014

2010-10-18

2011-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072923)

△通訊作者 Tel:0311-85110168;E-mail:gwj6088@163.com