陳新萍, 張 智, 劉絲蓀

(南昌大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產科，江西 南昌 330006)

胎盤ABCB4表達下調對膽汁酸排泌功能的負性調節(jié)作用及其對圍生兒預后的影響

陳新萍△, 張 智, 劉絲蓀

(南昌大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產科，江西 南昌 330006)

目的： 研究妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)患者胎盤ABCB4表達下調對胎兒膽汁酸排泌代謝的影響及其與胎兒圍生期預后的關系。方法采用RT-PCR和免疫組化技術檢測妊娠晚期ICP患者(30例，ICP組)和正常晚孕婦女(30例，對照組)胎盤組織中ABCB4 mRNA和蛋白的表達情況，采用化學氧化法和酶動力學法檢測母血膽紅素及轉氨酶，采用放射免疫分析方法檢測母血及臍血中的甘氨膽酸(GA)含量，并與胎兒圍生期預后進行相關性分析。結果對照組胎兒圍生期預后明顯好于ICP組，其新生兒體重和Apgar評分均高于ICP組(Plt;0.01)，而羊水糞染率低于ICP組(Plt;0.01)。兩組胎盤組織中均檢測到ABCB4 mRNA和蛋白的表達，但與對照組相比，ICP組胎盤組織ABCB4 mRNA和蛋白均明顯降低(Plt;0.01)。ICP組母血中丙氨酸轉氨酶、總膽紅素以及母血、臍血中GA水平均高于對照組(Plt;0.01)，而且，臍血GA、母血GA水平與ABCB4 mRNA呈明顯負相關(r=-0.627；r=-0.795，均Plt;0.01)。結論胎盤ABCB4表達下調對胎盤膽汁酸的排泌功能有負性調節(jié)作用，這可能是引起ICP圍生兒預后不良的重要機制之一。

妊娠期肝內膽汁淤積癥； 胎盤； 甘氨膽酸； ABCB4

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一種發(fā)生在妊娠中、晚期的常見病。ICP對母體無嚴重危害，但為胎兒窘迫、早產、羊水糞染、死胎和死產的主要原因之一[1,2]。ICP病因及發(fā)病機制研究多集中在母體方面：認為ICP的發(fā)生與母體肝臟膽淤相關基因如ABCB4基因(P-glycoprotein gene)的異常表達有密切關系，但有關膽淤相關基因在胎盤組織的研究較少。鑒于ICP對母體影響甚微而對胎兒危害嚴重的特點以及肝細胞與胎盤合體滋養(yǎng)細胞在結構和功能方面的相似性，我們從胎兒和胎盤組織膽汁酸代謝的角度，研究ICP患者胎盤組織ABCB4表達對胎兒膽汁酸代謝的影響及其對胎兒的危害。

材 料 和 方 法

1研究對象

2008年9月至2009年6月南昌大學第一附屬醫(yī)院的剖宮產病例60例。對照組30例：正常足月分娩妊娠婦女，平素月經規(guī)則，末次月經確切，年齡在20-38歲，均為單胎，無高血壓、糖尿病、心臟病和肝腎疾病史，無其它妊娠合并癥和并發(fā)癥；ICP組30例：按2008年《中華婦產科學》診斷標準診斷為ICP[1]，年齡為22-36歲，均于孕34-39周行剖宮產終止妊娠，孕前3個月或孕期服用過避孕藥或其它藥物、妊娠期有急慢性全身疾病、肝膽病史或自身免疫性疾病、有其它妊娠并發(fā)癥及合并癥或不能用ICP解釋的血、尿生化異常不納入本組實驗。所有實驗均通過醫(yī)院倫理委員會同意。

2方法

2.1標本收集 兩組孕婦胎盤娩出后，從母面中央取材，取胎盤組織塊約1 cm×1 cm×1 cm，10％甲醛固定，另取一部分置液氮保存。按常規(guī)方法測量新生兒身長、體重，準確稱量胎盤重量和新生兒Apgar評分。根據(jù)羊水性狀分為0°-Ⅲ°,0°羊水清;Ⅰ°呈淡黃色;Ⅱ°呈黃綠色;Ⅲ°呈棕黃色黏稠。Ⅰ°改變?yōu)檩p度污染，Ⅱ°-Ⅲ°為重度污染。血標本收集：(1)母體外周血：剖宮產術前在無菌條件下抽取對照組及ICP組孕婦空腹肘靜脈血各2管(3 mL/管)，一管送同位素室，置于2-8℃低溫冰箱保存統(tǒng)一待測；一管肝素抗凝送生化室進行丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase，ALT)及總膽紅素(total bilirubin,TBIL)的測定；(2)臍血標本采集：新生兒斷臍后，采集臍靜脈血2 mL置于干燥管，送同位素室，置于2-8 ℃低溫冰箱保存待測。

2.2孕婦肘靜脈血與胎兒臍靜脈血甘氨膽酸(glycocholic acid， GA)測定及孕婦肝功能測定 采用競爭性放射免疫分析法、酶動力學方法及化學氧化法檢測孕婦肘靜脈血與胎兒臍靜脈血GA和孕婦肝功能。GC-911 γ放射免疫計數(shù)儀由中國科大創(chuàng)新股份有限公司制造，試劑盒由北京中科院提供，實驗按試劑盒提供的步驟進行。參考正常值：空腹血清GA含量為(1.14±0.57)mg/L；空腹ALT:lt;40U/L；TBIL：1.71-17.10 mmol/L。

2.3胎盤組織ABCB4 mRNA測定 RT-PCR法行胎盤組織ABCB4 mRNA測定。在無菌試管內將-80 ℃冷凍的胎盤組織用生理鹽水洗滌至無血色，剪刀將其剪碎后放入勻漿器內攆成勻漿提取總RNA?？俁NA提取試劑 Biozol和BioRT逆轉錄擴增(RT-PCR)試劑盒均購自杭州博日科技有限公司。ABCB4片段長度312 bp，RT-PCR擴增上游引物5’- CTGCTGGAAAGATTGCAACAG-3’，下游引物5’-GAG CAA ATG AAC TCG CAT GTC-3’；內參照β-actin 長度521 bp，上游引物5’-CAC ACT GTG CCC ATC TAC GA-3’，下游引物5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’。PCR反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mixture 0.5 μL，10×PCR buffer 0.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，Taq mix DNA polymerase 2.5 μL，cDNA18 μL加水至25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min，35個循環(huán)。PCR產物常規(guī)行瓊脂糖凝膠電泳，采用面積吸光度值半定量分析測定胎盤組織中ABCB4 mRNA灰度值，與相應的β-actin灰度值相比，得出ABCB4 mRNA相對量。

2.4ABCB4蛋白在胎盤組織的表達 采用免疫組織化學方法檢測胎盤組織ABCB4蛋白表達。3-4 mm胎盤組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)于微波爐(高火煮沸6 min，中火20 min)修復抗原后，組織切片自然晾至室溫。3％H2O2室溫孵育10 min，封閉內源性過氧化物酶。PBS洗3次，5 min/次。抗ABCB4單抗(1∶10稀釋，艾碧康生物制品有限公司)孵育2 h。PBS洗 3次，5 min/次。中杉金橋Ⅱ抗室溫孵育30 min。PBS洗3次，5 min/次。DAB顯色10 min。蘇木素復染后，脫水，透明，中性樹膠封片，觀察結果。

3統(tǒng)計學處理

結 果

12組一般情況和圍生兒預后比較

ICP組與對照組孕婦平均年齡、孕次及產次無顯著差異(Pgt;0.05)，孕周差異顯著(Plt;0.01)，兩組母血ALT及ABIL顯著差異(Plt;0.01)。對照組新生兒體重和Apgar評分均高于ICP組，差異顯著(Plt;0.01)；對照組胎盤重量高于ICP組，差異顯著(Plt;0.05)；ICP組羊水糞染率高于對照組，差異顯著(Plt;0.01),見表1。

表1 ICP組與對照組孕婦一般情況、新生兒體重、Apgar評分、胎盤重量和羊水糞染的比較

2母血、臍血GA水平比較

ICP組母血血清GA為(26.86±8.51)mg/L，與對照組[(2.70±2.19)mg/L]相比差異顯著(Plt;0.01)。ICP組中臍血GA(19.97±8.80)mg/L,與對照組[(5.83±5.06)mg/L]相比顯著差異(Plt;0.01)，ICP組母血與臍血血清GA水平呈顯著正相關(r=0.588，Plt;0.01)，但對照組母血與臍血血清GA水平無相關關系(r=0.212，Pgt;0.05),見表2。

表2 ICP患者和正常孕婦母血、臍血GA相關性分析

3胎盤組織ABCB4mRNA和ABCB4蛋白的表達

在ICP組及正常晚孕組胎盤組織中均檢測到ABCB 4 mRNA，見圖1，與正常妊娠組相比，ICP組胎盤組織中ABCB4 mRNA的水平下降(Plt;0.01),而且，ABCB4 mRNA相對量與臍血GA和母血GA均呈負相關，其相關系數(shù)分別為r=-0.627(Plt;0.01)和r=-0.795(Plt;0.01)，見表3。免疫組化顯示ABCB4蛋白在ICP胎盤中的定位和正常胎盤組織中分布基本一致，均分布于合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜上，但是在正常妊娠胎盤組織中棕黃色顆粒顏色深,ICP胎盤組織棕黃色顆粒顏色較淺,見圖2。

Figure 1.RT-PCR analysis of ABCB4(312 bp) and β-actin(521 bp) mRNA expression.Lane 1,2: ICP group；Lane 3,4:control group.

表3 兩組胎盤ABCB4 mRNA相對量與母血、臍血GA相關性分析

Figure 2.Expression of ABCB4 protein in placenta tissues(immunohistochemical staining,×400).A:control group;B:ICP group.

討 論

母胎間膽汁酸經胎盤的轉運是妊娠期胎兒膽汁酸代謝的關鍵，胎兒血中膽汁酸必須首先通過載體蛋白經合體滋養(yǎng)細胞基底膜攝入合體滋養(yǎng)細胞，再通過滋養(yǎng)細胞母體側依賴轉運蛋白排出滋養(yǎng)細胞進入母體血液。生理妊娠情況下，胎兒膽汁酸水平高于母血中的水平，母胎間的膽汁酸濃度差有利于胎兒膽汁酸通過胎盤由母體排泄，使母胎膽汁酸處于動態(tài)平衡[3]。ICP時，由于母體膽汁淤積，母體肝細胞內的膽汁酸蓄積并逆流入體循環(huán)，母血膽汁酸水平升高，使得母胎間的膽汁酸濃度梯度不存在，胎盤的膽汁酸轉運系統(tǒng)可能同時受到損害，導致胎兒膽汁酸淤積[4]。本研究結果表明ICP組母血及臍血膽汁酸水平均明顯升高，且呈正相關，佐證了胎盤膽汁酸排泌功能受損可加重母胎高膽汁酸血癥對胎兒的危害[9]。

胎盤對膽汁酸的排泌與ABCB4蛋白有密切關系[5]。ABCB4蛋白是一種重要的載體蛋白，其基因定位于染色體7q21.1[6]，編碼產物即ABCB4蛋白，又名多藥耐藥蛋白，屬于p型糖蛋白(P-gp)超基因家族，其主要分布于肝臟毛細膽管膜，是肝臟毛細膽管膜磷脂輸出泵，能有效地轉運磷脂進入毛細膽管，在毛細膽管內膽鹽與磷脂可形成微膠粒，從而保護膽管細胞免受膽鹽損傷。肝細胞具有膜極性，由生化結構和生物功能均不同的基底膜(血竇面)和毛細膽管膜(肝內膽管面)組成，而胎盤合體滋養(yǎng)細胞也和肝細胞有著相似的結構，基底膜(胎兒面)和游離緣(母體面)質膜，并且同樣存在著相應的載體蛋白[7]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)影響膽汁酸代謝的ABCB4基因在胎盤組織中有著一定的表達。與正常組相比，ICP組ABCB4蛋白和mRNA較正常晚孕組的表達明顯下降，并且ABCB4 mRNA與臍血和母血甘膽酸呈負相關性，ABCB4蛋白在胎盤的作用可能類似于毛細膽管上的ABCB4蛋白，對維持胎盤的物質轉運和排毒功能可能起著必要性的作用，而ICP胎盤ABCB4蛋白表達下降可能影響胎盤排泌功能。因此，我們認為：ICP時，胎盤組織中ABCB4 mRNA 及ABCB4蛋白水平下降，也即胎盤母面的磷脂轉運蛋白減少，導致胎兒膽汁酸由胎盤排泌至母體血循環(huán)減少，引起胎兒體內膽汁酸蓄積。

ICP時，ABCB4 mRNA及ABCB4蛋白表達減少，使得胎盤從胎兒至母體方向排泌膽汁酸的效率下降，導致ICP胎兒血清膽汁酸明顯升高可以導致胎兒窘迫、早產、羊水糞染、死胎及死產等嚴重后果。本實驗結果證實，在ICP組，圍生兒胎兒窘迫發(fā)生率、羊水糞染發(fā)生率、早產的發(fā)生率均明顯高于對照組，進一步驗證了ICP時胎盤膽汁酸排泌功能受損可能是造成ICP胎兒預后不良的重要環(huán)節(jié)，而ICP胎盤排泌功能受損導致胎盤胎兒至母體方向膽汁酸濃度逆轉、胎兒循環(huán)膽汁酸水平增高是其主要機制之一[8]。Sepulveda等[9]的研究發(fā)現(xiàn)高濃度膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，可使人離體胎盤絨毛表面血管痙攣，絨毛靜脈阻力增加，推測可能導致胎兒血流灌注急劇下降，胎兒急性缺氧。Altshuler[10]等認為，由于膽汁酸是胎糞的主要成分，羊水胎糞污染時，羊水膽汁酸水平明顯升高，使得ICP胎盤絨毛板靜脈腔內(胎兒循環(huán))外(羊水)均暴露于高濃度的膽汁酸中，致絨毛板靜脈血管收縮，可能導致胎兒急性缺氧。大量的藥理學和毒理學基礎研究表明[11]，膽汁酸對動物和細胞具有明顯的毒理作用。口服大劑量膽汁酸可使動物迅速死亡，而長期較高濃度膽汁酸則有心臟功能抑制、血壓降低、免疫功能抑制和致癌等慢性毒性作用[12]。Bristes等[13]對因ICP 而死產新生兒的心肝腎組織進行病理檢查,發(fā)現(xiàn)心肌細胞、肝細胞、腎曲小管上皮細胞均呈空泡變性,肺泡腔充滿棕黃色顆粒,腎小管管腔內可見淡黃色均質管型。目前還有研究認為[14]ICP時，孕婦血中膽汁酸及膽紅素升高,高濃度的膽汁酸、膽紅素通過胎盤進入胎兒體內,通過其細胞毒作用破壞線粒體膜,產生氧自由基,直接損害胎兒細胞及組織，出現(xiàn)呼吸功能障礙和胎兒對氧的利用障礙,加上胎盤絨毛間腔縮小,血流量減少及血液流變學異常等,使胎兒的儲備力下降,易造成胎兒窘迫、死產、死胎及早產等。至于ICP組羊水糞染發(fā)生率的增高原因則可能與胎兒窘迫有直接關系。胎兒窘迫時，機體重新分布血流，血液主要分布于腦、心臟、腎上腺等重要器官，腸道和皮膚血流量減少，腸道缺血導致痙攣，肛門括約肌松弛使得大量胎糞排出，導致羊水糞染。

本實驗還提示ICP組圍生兒早產發(fā)生率高于對照組，這可能與 ICP組胎兒臍血中膽汁酸濃度明顯增高有關。Germain等[14]通過對人子宮肌纖維的研究發(fā)現(xiàn)，當膽汁酸與子宮肌細胞一起培養(yǎng)時，縮宮素受體表達增加。因此，ICP患者的子宮肌纖維對縮宮素的敏感性增加，使早產的發(fā)生率增高。動物實驗還表明，膽汁酸濃度增高可刺激胎膜、子宮內膜釋放前列腺素誘導早產。另外，隨著人們對ICP對圍生兒影響的認識加深，醫(yī)源性的剖宮產也增加了ICP患者早產的發(fā)生率。

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Down-regulationofABCB4expressioninplacentainhibitsglycocholicacidevacuationinfetusandisrelatedwithpoorprognosis

CHEN Xin-ping,ZHANG Zhi,LIU Si-sun

(DepartmentofObstetricsandGynaecology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:chenxpdr@163.com)

AIM: To investigate the relationship between ABCB4 (ATP-binding cassette,sub-family B,member 4) expression in placenta and glycocholic acid (GA) evacuation in fetus for evaluating the prognosis of fetus from women with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP).METHODSNormal pregnant women (control group,n=30) and ICP women (ICP group,n=30) hospitalized in our department were selected.The expression of ABCB4 mRNA and protein in placenta was detected by RT-PCR and immunohistochemistry,respectively.The total bilirubin (TBIL) and alanine aminotransferase (ALT) levels in maternal blood and the GA levels in maternal or umbilical blood were measured by chemical oxidation method,enzyme kinetics method and radioimmunoassay,respectively.RESULTSThe expression of ABCB4 mRNA and protein in placenta of ICP patients was significantly lower than that of the controls (Plt;0.01).The TBIL and ALT levels in maternal blood and the GA levels in both maternal and umbilical blood of ICP women were higher than those of the controls (Plt;0.01).The GA levels in maternal and umbilical blood were negatively correlated with the ABCB4 mRNA levels in placenta (r=-0.627 andr=-0.795,respectively,Plt;0.01).In control group,the weight and Apgar scores of the newborns were higher than those in ICP group (Plt;0.01).However,the rate of stool contamination in amniotic fluid was lower in control group than that in ICP group (Plt;0.01).CONCLUSIONDown-regulation of ABCB4 expression is involved in the impairment of bile acid secretion in placenta and may be a marker for poor prognosis of the fetus from ICP women.

Intrahepatic cholestasis of pregnancy; Placenta; Glycocholic acid; ABCB4

1000-4718(2011)05-1012-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.035

2010-12-26

2011-03-24

△通訊作者 Tel:0791-8692551;E-mail:chenxpdr@163.com