陳 琰， 肖若芝△， 王立琳， 何程明， 阮星星， 熊慕珺， 林東軍

(中山大學 1附屬第三醫(yī)院血液科，2血液病研究所，廣東 廣州 510630)

U0126增強索拉非尼對K562細胞增殖抑制、凋亡及誘導分化作用*

陳 琰1，2， 肖若芝1，2△， 王立琳1，2， 何程明1， 阮星星1， 熊慕珺1，2， 林東軍1，2

(中山大學1附屬第三醫(yī)院血液科，2血液病研究所，廣東 廣州 510630)

目的： 觀察索拉非尼、索拉非尼聯(lián)合MEK激酶抑制劑U0126對人慢性粒細胞白血病K562細胞株增殖、凋亡及分化的影響，并初步探討其機制。方法CCK-8法觀察索拉非尼、U0126單用及不同濃度索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126作用K562細胞48 h后細胞增殖活力變化；PI單染法及Hoechst 33342染色法觀察索拉非尼、U0126單用及索拉非尼聯(lián)合U0126對K562細胞株的凋亡誘導作用；細胞周期分析及聯(lián)苯胺染色觀察索拉非尼、U0126單用及低濃度索拉非尼聯(lián)合U0126是否誘導K562細胞株向紅系分化；采用免疫印跡法檢測c-Myc蛋白表達。結果MEK抑制劑U0126增強了索拉非尼對K562細胞增殖抑制、促凋亡及誘導分化作用。兩藥聯(lián)用顯著下調K562細胞c-Myc蛋白水平。結論MEK抑制劑U0126增強索拉非尼對K562細胞增殖抑制、凋亡及誘導分化作用,這可能與其協(xié)同下調c-Myc蛋白有關。

索拉非尼； U0126； K562細胞； 細胞凋亡； c-Myc

慢性粒細胞白血病特征性的分子生物學異常為BCR-ABL融合基因，其編碼的BCR-ABL蛋白可持續(xù)活化多條同細胞增殖有關的信號通路分子。盡管伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病療效顯著，但是還有部分病人出現(xiàn)伊馬替尼耐藥，尤其是在慢性粒細胞白血病加速期。因此，克服伊馬替尼耐藥成為亟待解決的問題。阻斷BCR-ABL活化的下游信號為當前克服伊馬替尼耐藥的熱點研究之一。索拉非尼(sorafeinb) 為多靶點抗腫瘤藥物，最初設計為Raf(絲裂原活化蛋白激酶信號轉導的關鍵調節(jié)者)激酶抑制劑，后來研究發(fā)現(xiàn)其能同時抑制其它多種酪氨酸激酶,如血管內皮生長因子、血小板衍化生長因子、受體酪氨酸激酶c-Kit、Fms樣酪氨酸激酶等多種受體酪氨酸激酶[1]。U0126為MEK激酶抑制劑，特異性抑制MEKK1激活，抑制MAPKs級聯(lián)反應。本研究以U0126聯(lián)合索拉非尼作用于體外培養(yǎng)的BCR-ABL陽性人慢性粒細胞白血病K562細胞株，探討U0126是否增強索拉非尼對K562細胞的增殖抑制、凋亡及分化誘導作用。

材 料 和 方 法

1材料

索拉非尼購于拜耳醫(yī)藥公司；U0126購于Alexis；小牛血清購于杭州四季青公司；逆轉錄試劑盒購于Fermentas；Trizol試劑為Invitrogen產品；RPMI-1640培養(yǎng)基、CCK-8細胞毒力和細胞活性檢測試劑盒、細胞周期試劑盒均購于南京凱基生物發(fā)展有限公司；Hoechst 33342購于Sigma；鼠抗GAPDH和兔抗c-Myc單克隆抗體購自Cell Signaling Technology。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) K562、U937細胞株為中山大學附屬第三醫(yī)院中心實驗室保留。使用添加10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5％CO2孵育箱內。根據(jù)細胞生長情況，每天換液1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2PCR法檢測b3a2BCR-ABL融合基因 對K562細胞BCR-ABL融合基因進行檢測，并以U937細胞株作為陰性對照。應用Trizol試劑提取K562和U937細胞總RNA，核酸蛋白分析儀檢測含量。0.5 μg總RNA按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA。b3a2BCR-ABL上游引物5’-GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC-3’，下游引物5’-TCAGACCCTGAGGCCCTGAGGCTCAAAGTC-3’，擴增產物的長度為200bp。β-actin上游引物5’- TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，下游引物5’- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG -3’，擴增產物的長度為294 bp。PCR擴增條件：PCR熱循環(huán)儀中，94 ℃預變性5 min，然后94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

2.3CCK-8法測定細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的K562細胞，1×104cells/well接種于96孔板，每孔體積100 μL。置于37 ℃、5％CO2孵育箱內培養(yǎng)12 h后，空白對照組以不含索拉非尼的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，實驗組以含不同濃度的索拉非尼、U0126及不同濃度索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126培養(yǎng)，并設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃、5％CO2孵育箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定吸其光(A值)，增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100％。

2.4PI單染法檢測細胞周期及凋亡 K562細胞以 1×106cells/well，每孔體積2 mL接種于12孔板，實驗組以含不同濃度的索拉非尼或是聯(lián)合10 μmol/L U0126的培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后收集細胞，PBS洗滌2次，緩慢滴入1 mL 70％預冷的乙醇固定過夜，第2 d檢測前離心除去乙醇，500 μL PBS重懸，加入RNase至終濃度為100 mg/L,37 ℃水浴30 min，加入PI染液至終濃度為50 mg/L,4 ℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長為488 nm的紅色熒光，結果用細胞周期擬合軟件進行分析，記錄亞二倍體峰，即凋亡細胞峰sub-G1期、G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例，實驗重復3次。

2.5Hoechst 33342染色觀察K562細胞凋亡形態(tài) K562細胞以1×106cells/well，每孔體積3 mL接種于6孔板，分別用5 μmol/L索拉非尼、10 μmol/L U0126及5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126培養(yǎng)，并設置空白對照，48 h后加入Hoechst 33342，使其終濃度為10 mg/L,培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育30 min后收集細胞，避光。PBS洗滌后以甲醛固定，并調整細胞濃度為2×109cells/L，將細胞懸液滴于載玻片，加蓋蓋玻片，稍干燥后用有紫外光的熒光顯微鏡觀察,正?；罴毎w積較大、形態(tài)完整、染色均一、藍色熒光相對較弱，凋亡細胞體積變小、核固縮、核裂解、形狀不規(guī)則、熒光強度增強，每個樣品計數(shù)200個細胞，計出凋亡細胞百分數(shù)，實驗重復3次。

2.6聯(lián)苯胺染色檢測K562細胞向紅系方向分化 K562細胞以1×109cells/L，每孔體積5 mL接種于6孔板，分別用5 μmol/L索拉非尼、10 μmol/L U0126及5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126培養(yǎng)，并設置空白對照，48 h后收集細胞，PBS洗滌并調整細胞濃度為2×109cells/L，取出50 μL。0.5 mol/L冰乙酸配置的0.2％(W/V)聯(lián)苯胺液0.5 mL加入30 μL H2O2混勻后取出10 μL加入到細胞中，2 min后加入5％(W/V)亞硝基鐵氰化鈉1 μL搖勻，室溫避光放置10 min，5 min內顯微鏡拍攝觀察，計數(shù)200個細胞，染為藍色的即是聯(lián)苯胺陽性細胞，提示藥物誘導K562細胞合成血紅蛋白，向紅系分化，未染色的為陰性細胞，求聯(lián)苯胺染色陽性細胞率，實驗重復3次。

2.7Western blotting法檢測c-Myc蛋白 K562細胞以1×109cells/L，每孔體積2 mL接種于6孔板，以含不同濃度索拉非尼或聯(lián)合10 μmoL/L的U0126的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并設空白對照。48 h后收集細胞，冰上裂解，靜置10 min后以12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清。制作蛋白標準曲線后測定樣品蛋白實際濃度，置于-80 ℃。固定好電泳裝置，灌制分離膠及濃縮膠，凝固后，將電泳裝置放入裝有電泳液的槽中，取40 μg的樣品加入6×SDS上樣緩沖液后沸煮5 min，冷卻后于上樣孔加樣。加樣完畢后，電泳至溴酚藍線到達濃縮膠最下緣結束。根據(jù)蛋白分子量切取合適大小的分離膠及PV膜于轉膜液中進行轉膜。轉膜完畢后，室溫下以5％牛血清蛋白封閉1 h。膜與Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫下孵育1 h，化學發(fā)光，X膠片顯影，掃描后用Quantity One軟件分析。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1K562細胞BCR-ABL融合基因的鑒定

PCR法顯示K562細胞為b3a2BCR-ABL陽性細胞株，BCR-ABL有多連接方式，最常見的為b3a2型，該基因經轉錄后翻譯成相對分子量為210 kD的蛋白質，即P210BCR-ABL。對照組U937細胞則不表達BCR-ABL融合基因,見圖1。

Figure 1.Detection of b3a2 BCR-ABL in K562 cell line by PCR.

2U0126增強索拉非尼對K562細胞株的增殖抑制作用

CCK-8檢測結果顯示索拉非尼單藥對K562細胞具有增殖抑制作用，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，48 h索拉非尼作用于K562細胞的IC50濃度為14.02 μmol/L，U0126單用增殖抑制趨勢不明顯。索拉非尼5 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L聯(lián)合10 μmol/L的U0126后，K562細胞增殖抑制率明顯高于索拉非尼單用(Plt;0.01)，見圖2。

3U0126增強索拉非尼對K562細胞株的誘導凋亡作用

選擇小于IC50濃度的索拉非尼觀察單用及聯(lián)合U0126作用K562細胞的效果。PI單染法測定藥物作用后Sub-G1細胞比例，即凋亡細胞比例。結果顯示10 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126作用K562細胞48 h后，細胞凋亡率明顯高于索拉非尼、U0126單用(Plt;0.01)，見圖3。Hoechst 33342染色法觀察10 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126作用K562細胞48 h后，核固縮和核碎裂陽性細胞比例明顯高于索拉非尼、U0126單用(Plt;0.01)，見圖4，從形態(tài)學上證實了U0126增強了索拉非尼對K562細胞的誘導凋亡作用。

Figure 2.Growth inhibitory effect of sorafenib,U0126 or sorafenib combined 10 μmol/L U0126 on K562 cells for 48 h±s.n=3.**Plt;0.01 vs sorafenib.

Figure 3.The apoptotic rate of K562 cells was determined with PI staining after exposure to indicated drugs for 48 h.A:control;B:U0126(10 μmol/L);C:sorafenib(10 μmol/L);D:U0126(10 μmol/L)+sorafenib(10 μmol/L).±s.n=3.**Plt;0.01 vs control;##Plt;0.01 vs U0126;△△Plt;0.01 vs sorafenib.

Figure 4.K562 cells were stained with Hoechst 33342 to identify condensed apoptotic nuclei after exposure to indicated drugs for 48 h.A:control;B:U0126(10 μmol/L);C:sorafenib(10 μmol/L);D:U0126(10 μmol/L)+sorafenib(10 μmol/L).±s.n=3.**Plt;0.01 vs control;##Plt;0.01 vs U0126;△△Plt;0.01 vs sorafenib.

4U0126增強索拉非尼對K562細胞株的周期及誘導分化影響

索拉非尼5 μmol/L、U0126 10 μmol/L單用及聯(lián)合作用K562細胞48 h后，細胞周期分析結果顯示：5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126組G0/G1期細胞比例(62.22％±2.88％)高于對照(46.14％±2.38％)、索拉非尼(47.20％±1.15％)及U0126(42.00％±1.84％)單用，而兩藥聯(lián)合S期細胞比例(37.38％±2.75％)低于對照(47.27％±2.63％)、索拉非尼(48.29％±0.92％)及U0126(55.85％±1.86％)單用(Plt;0.05)，見表1，提示兩藥聯(lián)合較單藥引起更明顯的G0/G1期阻滯，K562細胞分裂及增殖活性降低，在G0/G1檢測點聚集最終走向分化或者凋亡。而5 μmol/L索拉非尼聯(lián)合10 μmol/L U0126未導致明顯凋亡，說明低濃度索拉非尼聯(lián)合U0126主要以誘導腫瘤細胞分化為主。聯(lián)苯胺染色證實U0126聯(lián)合低濃度索拉非尼更明顯地促進K562細胞產生血紅蛋白并向紅系方向分化，聯(lián)苯胺染色陽性率上升(Plt;0.05)，見圖5。

Figure 5.K562 cells were stained with benzidine after exposured to lower concentrations of sorafenib,U0126 or combination of both for 48 h.A:control;B:U0126(10 μmol/L);C:sorafenib(5 μmol/L);D:U0126(10 μmol/L)+sorafenib(5 μmol/L).*Plt;0.05 vs control;#Plt;0.05 vs U0126;△Plt;0.05 vs sorafenib.

5索拉非尼聯(lián)合U0126顯著下調c-Myc蛋白水平

Western blotting法顯示索拉非尼聯(lián)用U0126作用48 h后，c-Myc蛋白水平較之索拉非尼、U0126單用明顯降低(Plt;0.05)，見圖6，提示U0126增強索拉非尼對K562細胞增殖抑制、凋亡及分化誘導作用可能與其協(xié)同下調c-Myc蛋白有關。

表1 索拉非尼、U0126單藥及聯(lián)合作用于K562細胞48 h后細胞周期分布

Figure 6.Western blotting analysis of c-Myc protein expression in K562 cells treated with sorafenib,U0126 or combination of both for 48 h.*Plt;0.05 vs control;#Plt;0.05 vs U0126;△Plt;0.05 vs sorafenib.

討 論

慢性粒細胞白血病(CML)起源于造血干細胞的致癌性轉變，其標志性的遺傳學異常為t(9;22)(q34;q11)染色體易位，此易位形成了BCR-ABL融合基因，編碼BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL融合蛋白具有組成性酪氨酸激酶活性，可活化一系列胞內信號通路并激活RAS、PI3K、AKT、JNK、SRC家族激酶及各自的下游靶點，如轉錄因子STATs、NF-κB、Myc等[2]。伊馬替尼可有效抑制P210 BCR-ABL融合蛋白，誘導95％慢性期CML患者血液學的完全緩解，盡管如此，患者骨髓中仍持續(xù)產生BCR-ABL基因轉錄產物。另外，還有部分病人出現(xiàn)伊馬替尼耐藥，尤其是在慢性粒細胞白血病加速期。伊馬替尼耐藥最主要的原因為ABL激酶區(qū)域的點突變改變了ATP口袋結構構象，影響了藥物同其靶點結合[3]。當前，克服伊馬替尼耐藥的治療策略包括運用第二代激酶抑制劑、造血干細胞移植及靶向BCR-ABL依賴的信號轉導途徑。異基因造血干細胞移植是唯一治愈CML的手段，但是大多數(shù)病人不適宜采用此種療法，主要原因在于患者年齡過大難以耐受治療帶來的副反應或是缺乏合適的干細胞供者。第二代酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼及尼諾替尼雖然能抑制大部分不同形式突變后的激酶活性，但其對T315I突變無效。因此，開發(fā)及研究以BCR-ABL活化的下游信號為靶點的藥物具有潛在的前景，尤其是對T315I突變所致的耐藥。

目前，較多研究證明多激酶抑制劑索拉非尼可在體外誘導多種白血病細胞株凋亡，包括BCR-ABL陽性的白血病細胞[4]，抑制生存及增殖的機制包括阻斷Raf/MEK/ERK通路，下調Mcl-1表達以及誘導內質網應激[4-6]。U0126為高效MEK激酶抑制劑，直接抑制ERK1/2上游激活物MEK蛋白的活性而抑制ERK磷酸化。有研究顯示U0126聯(lián)合伊馬替尼協(xié)同誘導BCR-ABL陽性細胞株凋亡[7]。另外，其聯(lián)合雷帕霉素、Bcl-2抑制劑GX15070可在體外誘導伊馬替尼耐藥細胞株凋亡[8]。

本實驗中，U0126增強索拉非尼對K562細胞增殖抑制作用，低濃度索拉非尼聯(lián)合U0126促進K562細胞向分化方向發(fā)展，而高濃度索拉非尼聯(lián)合U0126誘導K562細胞凋亡。索拉非尼、U0126聯(lián)用后c-Myc蛋白明顯下調，提示U0126增強索拉非尼增殖抑制、誘導凋亡及分化的機制可能在于兩藥協(xié)同下調c-Myc蛋白。c-myc為細胞增殖調控的早期反應基因，其編碼的c-Myc蛋白為一種轉錄因子。當細胞向分化方向發(fā)展時，c-Myc表達下調。染色體異位、點突變及上游調節(jié)因子缺乏可過度活化c-Myc導致細胞致癌性轉變，促進白血病及一些實體腫瘤形成。慢性粒細胞白血病患者急性變時，常有c-Myc過表達[9]。BCR-ABL可通過其組成性活化胞內多種信號轉導分子誘導c-Myc過表達。索拉非尼可能通過抑制多種細胞表面及細胞內激酶阻斷BCR-ABL活化的生存信號下調c-myc基因表達，進而下調c-Myc蛋白。U0126通過抑制MEK蛋白減少活性形式的ERK蛋白產生，進而減少ERK磷酸化其下游靶點c-Myc，弱化其活化轉錄能力。兩者聯(lián)用協(xié)同下調了具有轉錄活性的c-Myc蛋白水平。另外，Myc蛋白可與Miz-1蛋白相互作用抑制P21的表達從而阻斷P53誘導的細胞周期阻滯[10,11]，索拉非尼可能通過下調c-Myc而穩(wěn)定P21導致細胞周期阻滯，而U0126則剛好強化了此作用，促進K562向紅系方向分化。因此，索拉非尼聯(lián)合U0126則可能成為治療伊馬替尼耐藥的CML的可行方案。

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U0126enhancessorafenib-inducedproliferationinhibition,apoptosisanddifferentiationinK562cells

CHEN Yan1,2,XIAO Ruo-zhi1,2,WANG Li-lin1,2,HE Cheng-ming1,RUAN Xing-xing1,XIONG Mu-jun1,2,LIN Dong-jun1,2

(1DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,2InstituteofHematology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:E-mail:ruozhi_xiao@yahoo.com)

AIM: To observe the effects of sorafenib and sorafenib combined with an MEK kinase inhibitor U0126 on the proliferation,apoptosis and differentiation in human chronic myelogenous leukemia cell line K562.METHODSK562 cells were treated with different concentrations of sorafenib and U0126 or 10 μmol/L U0126 combined with different concentrations of sorafenib for 48 h.Cell inhibitory rate was determined by CCK-8 assay.Apoptosis analysis was conducted by Hoechst 33342 and PI staining.Cell cycle analysis and benzidine staining were used to confirm K562 cells towards erythroid differentiation.The protein expression of c-Myc was detected by Western blotting.RESULTSU0126 enhanced sorafenib-induced proliferation inhibition,apoptosis and differentiation in K562 cells.Sorafenib combined with U0126 remarkably reduced the protein level of c-Myc.CONCLUSIONU0126 synergistically enhances sorafenib-induced proliferation inhibition,apoptosis and differentiation in K562 cells through reducing c-Myc protein level.

Sorafenib; U0126; K562 cells; Apoptosis; c-Myc

1000-4718(2011)05-0859-06

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.006

2010-11-30

2011-03-21

廣東省科技計劃資助項目 (No.2006B35501008)

△通訊作者Tel: 020-85252227; E-mail: ruozhi_xiao@yahoo.com