陳 默， 殷嘯俊， 堯良清△， 李 娜， 竺鵬飛， 徐叢劍

(1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200001；2昆山市第二人民醫(yī)院婦科，江蘇 昆山 215300)

缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)機(jī)制的實驗研究*

陳 默1， 殷嘯俊2， 堯良清1△， 李 娜1， 竺鵬飛1， 徐叢劍1

(1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200001；2昆山市第二人民醫(yī)院婦科，江蘇 昆山 215300)

目的： 在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行缺氧刺激，可誘導(dǎo)卵巢惡性上皮性腫瘤細(xì)胞SKOV-3和ES-2向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，本文擬探討其相關(guān)的分子機(jī)制。方法建立Matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)，在1％O2缺氧條件下，誘導(dǎo)卵巢上皮性癌細(xì)胞SKOV-3和ES-2向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)后，應(yīng)用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)和實時熒光定量RT-PCR檢測原始腫瘤細(xì)胞、腫瘤內(nèi)皮樣細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)端粒酶活性以及周期蛋白cyclinD1、抑癌基因p53、原癌基因v-src轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果常氧時，SKOV-3和ES-2細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)為陽性，缺氧誘導(dǎo)后SKOV-3內(nèi)皮樣細(xì)胞端粒酶活性為陽性，而ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞端粒酶活性轉(zhuǎn)為陰性。缺氧誘導(dǎo)后的SKOV-3和ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞cyclinD1 mRNA的表達(dá)顯著低于常氧時SKOV-3和ES-2的表達(dá)(Plt;0.05或Plt;0.01)；和HUVECs的表達(dá)無顯著差異。SKOV-3和ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞p53 mRNA的表達(dá)顯著高于常氧時SKOV-3、ES-2和HUVECs的表達(dá)(Plt;0.05或Plt;0.01)。缺氧和常氧狀態(tài)下各種細(xì)胞均不表達(dá)v-src mRNA。結(jié)論缺氧可以誘導(dǎo)少量卵巢上皮性癌細(xì)胞SKOV-3和ES-2向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，主要是通過改變端粒酶的活性，調(diào)節(jié)cyclinD1和p53的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用。

卵巢腫瘤； 缺氧； 血管內(nèi)皮樣細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 端粒酶； 細(xì)胞周期蛋白D1； 基因,p53； 基因,v-src

卵巢癌(ovarian carcinoma)在女性生殖道癌腫中死亡率居首位，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧刺激能夠誘導(dǎo)少量上皮性卵巢癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，同時增加其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移特性，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1,2]。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞為非惡性腫瘤細(xì)胞，因此本文擬研究缺氧誘導(dǎo)部分卵巢癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)分化前后細(xì)胞與正常內(nèi)皮細(xì)胞在癌基因、原癌基因、周期蛋白及端粒酶的表達(dá)差異，以期探討缺氧刺激上皮性卵巢惡性腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)的實質(zhì)及其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞來源及培養(yǎng) 卵巢上皮性癌細(xì)胞系SKOV-3(No.HTB-77，腺癌來源)和ES-2(No.CRL-1978，透明細(xì)胞癌來源)均購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(American Type Culture Collection，ATCC)。根據(jù)ATCC指引，用Mccoy’s 5A培養(yǎng)、傳代。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，來自本院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)或順產(chǎn)的新生兒臍帶，長度gt;30 cm，無菌條件下沖洗血跡，臍靜脈管腔內(nèi)注入0.25％胰酶+EDTA消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min分離獲得消化液轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中送細(xì)胞培養(yǎng)室，完全培養(yǎng)基(M199+10％胎牛血清)37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后換液，以后每2-3 d半量換液1次，觀察細(xì)胞生長情況，可見鋪路石樣細(xì)胞。傳代至第3代時進(jìn)行下一步實驗。

1.2主要試劑及儀器設(shè)備 胎牛血清購自Hyclone，Mccoy’s 5A購自Gibco，Matrigel膠購自Bamp;D；TRAP-Hyb kit端粒酶活性檢測試劑盒購自華美生物工程公司；2.5 L缺氧盒購自Mitsubishi；細(xì)胞周期分析軟件Mob Forltnacv 1.01(Bamp;D)；Rotor-Gene3000 實時PCR儀(Corbett Research)；Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft)。

2方法

2.1Matrigel三維培養(yǎng)及缺氧誘導(dǎo) Matrigel三維培養(yǎng)將Matrigel與含15％FBS 的Mccoy’s 5A 培養(yǎng)基按1∶1(V/V)混合，滴入培養(yǎng)板中，37 ℃孵育凝膠；分別將對數(shù)生長期SKOV-3和ES-2消化成單細(xì)胞懸液，接種在Matrigel培養(yǎng)系統(tǒng)；分別在常氧(O2濃度為21％)、缺氧(O2濃度為1％)等條件下每隔48 h更換上述培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)7 d。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于缺氧盒中，1％O2模擬缺氧環(huán)境。

2.2體外誘導(dǎo)形成腫瘤內(nèi)皮樣細(xì)胞的鑒定 采用免疫組織化學(xué)熒光雙重標(biāo)記腫瘤內(nèi)皮樣細(xì)胞特異性抗原，透射電鏡下觀察腫瘤內(nèi)皮樣細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，檢測相關(guān)細(xì)胞acLDL吞噬功能等方法對SKOV-3細(xì)胞及ES-2細(xì)胞在缺氧誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮樣細(xì)胞及原代培養(yǎng)獲得的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。具體方法見本課題組前期實驗結(jié)果[1]。

2.3卵巢癌內(nèi)皮樣細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞端粒酶活性的檢測 收集實驗2.1各組細(xì)胞及常氧下原代培養(yǎng)獲得的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，按端粒酶活性試劑盒說明書逐步操作。結(jié)果判斷：酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光度值(A值)。其中陽性對照為人胚腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞系293細(xì)胞，陰性對照為65 ℃處理30 min的293細(xì)胞獲得。陰性對照A值低于0.05按0.05計算，高于0.05按實際A值計算。若A值大于0.3，則判斷為無效，需重做實驗。樣本A值大于陰性對照A值的2.1倍時，判為端粒酶活性陽性。

2.4實時定量RT-PCR檢測抑癌基因p53、原癌基因v-src和周期蛋白cyclin D1的表達(dá) (1)引物的設(shè)計：應(yīng)用Primer Premier 5.10軟件設(shè)計，掃描人類基因庫中未發(fā)現(xiàn)的其它同源序列。Cyclin D1:上游引物5’-GATGCCAACCTCCTCAACGAC-3’,下游引物5’- CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC-3’,產(chǎn)物片段為171 bp;p53:上游引物5’-GCTGCTCAGATAGCGATGGTC-3’，下游引物5’-CTCCCAGGACAGGCACAAACA-3’，產(chǎn)物片段為298 bp；v-src：上游引物5’-CACTCGCTCAGCACAGGACAG-3’，下游引物5’-AGAGGCAGTAGGCACCTTTCG-3’，產(chǎn)物片段為196 bp；β肌動蛋白(β-actin):上游引物5’-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3’，下游引物5’-GAGACCTTCAACACCCC-3’，產(chǎn)物片段為230 bp。(2)RNA含量及純度測定：收集實驗2.1各組細(xì)胞及常氧下原代培養(yǎng)獲得的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別提取總RNA，測定RNA含量及純度。(3)RT反應(yīng)：20 μL反應(yīng)體系，按照RT試劑盒操作步驟進(jìn)行，合成cDNA。(4)PCR反應(yīng)：20 μL反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min,結(jié)束溫度為4 ℃。(5)結(jié)果與計算：各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1卵巢癌內(nèi)皮樣細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞端粒酶活性的表達(dá)

常氧時SKOV-3和ES-2細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)為陽性，缺氧誘導(dǎo)后SKOV-3內(nèi)皮樣細(xì)胞端粒酶活性為陽性，而ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)為與人臍靜脈細(xì)胞相似，端粒酶活性為陰性，見表1、2。

表1 SKOV-3及其內(nèi)皮樣細(xì)胞端粒酶活性的檢測

表2 ES-2及其內(nèi)皮樣細(xì)胞端粒酶活性的檢測

2體外誘導(dǎo)形成腫瘤內(nèi)皮樣細(xì)胞的鑒定

本課題組前期實驗結(jié)果已表明[1]：缺氧可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和ES-2轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮樣細(xì)胞，并形成腔樣、管狀、分支和網(wǎng)絡(luò)狀等擬態(tài)血管。SKOV-3內(nèi)皮樣細(xì)胞可表達(dá)Flk-1、AC133和vWF；細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，表面出現(xiàn)微絨毛樣突起，極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)膜包裹的顆粒。ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞可以表達(dá)Flk-1和CD34；細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，表面出現(xiàn)微絨毛樣突起，極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)膜包裹的顆粒；部分細(xì)胞局部胞漿出現(xiàn)Dil陽性細(xì)胞，具有吞噬acLDL功能。HUVECs的鑒定：vWF表達(dá)陽性，具有acLDL吞噬功能，胞內(nèi)含Weibel-Palade小體。

3卵巢癌內(nèi)皮樣細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞cyclinD1、p53和v-srcmRNA的表達(dá)

缺氧誘導(dǎo)后SKOV-3內(nèi)皮樣細(xì)胞cyclin D1 mRNA的表達(dá)顯著低于常氧時的表達(dá)(Plt;0.01)；與HUVECs表達(dá)比較無顯著差異(Pgt;0.05)；p53 mRNA表達(dá)顯著高于常氧時的表達(dá)(Plt;0.01)，也顯著高于HUVECs的表達(dá)(Plt;0.01)；v-src mRNA的表達(dá)與常氧和HUVECs比較均無顯著差別(Pgt;0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of cyclin D1，p53 and v-src mRNA in SKOV-3 and SKOV-3 endothelial -like cells.Analysis of real-time RT-PCR at the 7th day revealed that hypoxia decreased the mRNA expression of cyclin D1 and increased the expression of p53 in SKOV-3 cells.No significant difference of v-src mRNA expression was observed under all conditions.±s.n=3.**Plt;0.01 vs SKOV-3 in normoxia.

缺氧誘導(dǎo)后ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞cyclin D1 mRNA的表達(dá)顯著低于常氧時的表達(dá)(Plt;0.05)；與HUVECs表達(dá)比較無顯著差異(Pgt;0.05)；p53 mRNA表達(dá)顯著高于常氧時的表達(dá)(Plt;0.01)，并顯著高于HUVECs表達(dá)(Plt;0.01)；v-src mRNA的表達(dá)與常氧和HUVECs比較均無顯著差別(Pgt;0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of cyclin D1，p53 and v-src mRNA in ES-2 and ES-2 endothelials-like cells.Analysis of real-time RT-PCR at the 7th day revealed that hypoxia significantly decreased the mRNA expression of cyclin D1 and increased the expression of p53 in ES-2 cells.No significant difference of v-src mRNA expression was observed under all conditions±s.n=3.**Plt;0.01 vs ES-2 in normoxia.

討 論

局部氧分壓降低是幾乎所有實體腫瘤的特征，腫瘤細(xì)胞團(tuán)增至1 mm×1 mm×1 mm或更大時，中央缺氧，此時腫瘤對微環(huán)境缺氧存在自身調(diào)節(jié)和適應(yīng)[3]。本課題組前期實驗中，證實缺氧可影響SKOV-3和ES-2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布、凋亡及侵襲等生物學(xué)行為[2]。同時證明，缺氧可以將卵巢上皮性癌細(xì)胞SKOV-3和ES-2誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，形成擬態(tài)血管，為腫瘤提供血供；惡性程度越高的腫瘤，形成擬態(tài)血管能力越強(qiáng)[1-3]。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞為非惡性腫瘤細(xì)胞，本文研究缺氧誘導(dǎo)部分卵巢癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)分化前后細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞在端粒酶、周期蛋白、癌基因及原癌基因的表達(dá)差異。

端粒酶的表達(dá)對于維持干細(xì)胞自我更新能力和復(fù)制潛能有重要意義；端粒的長度，使得腫瘤細(xì)胞不斷增殖，以致永生化[4-7]。本文結(jié)果表明，SKOV-3在缺氧前后端粒酶活性表達(dá)均為陽性，端粒酶活性沒有發(fā)生改變，此時SKOV-3內(nèi)皮樣細(xì)胞仍未完全分化為終末細(xì)胞，我們推測其可能還具有腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell,TSC)屬性，有可能被進(jìn)一步誘導(dǎo)[8]。ES-2在缺氧前端粒酶活性陽性，缺氧后ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞的端粒酶活性轉(zhuǎn)為陰性，表明 ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞已喪失腫瘤細(xì)胞的增殖特性，同時也喪失了TSC的復(fù)制潛能，ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為具有特定功能與標(biāo)記的終末細(xì)胞。

干細(xì)胞的特性是不斷地增殖與分化，而其進(jìn)行增殖分化的前提是進(jìn)入細(xì)胞周期。干細(xì)胞周期調(diào)控與其它哺乳動物細(xì)胞一樣，也是通過各種細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶等相互作用來完成的。Cyclin D1合成是細(xì)胞接受外界信號刺激而進(jìn)入細(xì)胞周期的最早期事件，它推動細(xì)胞進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期進(jìn)入不依賴細(xì)胞外信號刺激的不可逆階段[9-12]。本研究結(jié)果表明，缺氧后SKOV-3內(nèi)皮樣細(xì)胞和ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞cyclin D1表達(dá)顯著下降，和HUVECs無顯著差異。由此我們可以推論：缺氧誘導(dǎo)后的腫瘤細(xì)胞SKOV-3和ES-2受cyclin D1的調(diào)控減少，從而停滯在G期而增殖分化受阻，使其惡性程度降低。表明cyclin D1在調(diào)控卵巢癌細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化中具有重要的作用。

在腫瘤發(fā)生過程中，抑癌基因p53功能喪失是目前最常檢測到的變化之一，其中卵巢癌中的突變率高達(dá)30％-79％。缺氧誘導(dǎo)因子-1能對野生型P53蛋白的降解起抑制作用，穩(wěn)定P53使之水平升高，而對突變型P53無作用[13-16]。本研究結(jié)果表明，野生型p53在SKOV-3和ES-2細(xì)胞中表達(dá)極弱或喪失；經(jīng)缺氧誘導(dǎo)后，在SKOV-3和ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞表達(dá)水平顯著升高，也顯著高于HUVECs表達(dá)。本結(jié)果提示，從抑癌基因p53表達(dá)的角度來看，缺氧通過上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)來使SKOV-3和ES-2原有的惡性腫瘤細(xì)胞屬性降低或喪失。

v-src基因是一個促進(jìn)細(xì)胞分化并參與其調(diào)節(jié)的癌基因[17]，本研究結(jié)果顯示，無論是缺氧前或后，SKOV-3和ES-2，或者它們的內(nèi)皮樣細(xì)胞均不能檢測到v-src mRNA表達(dá)，提示v-src癌基因沒有參與卵巢癌細(xì)胞SKOV-3或ES-2的發(fā)生與發(fā)展，沒有參與缺氧誘導(dǎo)出現(xiàn)SKOV-3和ES-2內(nèi)皮樣細(xì)胞形成的過程。

缺氧是卵巢上皮性癌血管生成擬態(tài)的主要誘導(dǎo)因素之一。在缺氧狀態(tài)下，正常內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制，無法為腫瘤生長提供足夠血供。而此時卵巢癌細(xì)胞干細(xì)胞潛能優(yōu)先向血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)展，以滿足其惡性發(fā)展的需要。根據(jù)本研究，我們推測：卵巢癌細(xì)胞向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化表面上看其發(fā)生逆分化，惡性程度降低；但是從長遠(yuǎn)的發(fā)展，腫瘤血管的生成為腫瘤的生長提供了養(yǎng)分和轉(zhuǎn)移的途徑，增加了其危害性，因此，缺氧對上皮性卵巢癌生長發(fā)展具有雙刃劍的作用。如何阻斷其逆分化，針對逆分化后腫瘤內(nèi)皮樣細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，有望為卵巢癌提供潛在的治療靶點(diǎn)。

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Molecularmechanismofretrodifferentiationfromepithelialovariancancercellsinducedbyhypoxia

CHEN Mo1,YIN Xiao-jun2,YAO Liang-qing1,LI Na1,ZHU Peng-fei1,XU Cong-jian1

(1DepartmentofGynecology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200001,China;2DepartmentofGynecology,TheSecondPeople’sHospitalofKunshanCity,Kunshan215300,China.E-mail:yaoliangqingcn@126.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of retrodifferentiation from epithelial ovarian cancer into vascular endothelial-like cells induced by hypoxia.METHODSThe three-dimensional culture system with Matrigel was established to culture SKOV-3 and ES-2 ovarian cancer cell lines under hypoxic condition (1％ O2).Telomeric repeat amplification protocol (TRAP) and real-time RT-PCR were used to analyze the activity of telomerase and the mRNA expression of cyclin D1,p53 and v-src in endothelial-like cells differentiated from the microdissected tumors.The data were compared with those in original cancer cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).RESULTSThe activity of telomerase was positive in SKOV-3 and ES-2 cells under normoxic condition,and was positive in SKOV-3 endothelial-like cells but negative in ES-2 endothelial-like cells under hypoxic condition.The mRNA expression of cyclin D1 in SKOV-3 and ES-2 endothelial-like cells with hypoxia was significantly lower than that in the same cells with normoxia (Plt;0.01),but was not significantly different from that in HUVECs (Pgt;0.05).In SKOV-3 and ES-2 endothelial-like cells,the mRNA expression of p53 was higher with hypoxia than that with normoxia.No expression of v-src mRNA in all kinds of the cells under either hypoxic or normoxic condition was detected.CONCLUSIONHypoxia induces the differentiation of SKOV-3 and ES-2 cells into vascular endothelial-like cells by decreasing telomerase activity and cyclin D1 expression,and the increasing the mRNA expression of p53.

Ovarian neoplasms; Hypoxia; Vascular endothelial-like cells; Cell differentiation; Telomerase; Cyclin D1; Genes,p53; Genes,v-src

1000-4718(2011)05-0848-05

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.004

2011-01-31

2011-04-15

上海市科委自然科學(xué)基金資助項目(No.08ZR1401900)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金資助項目(No.20070246020)

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