李旺林, 蘭 平, 吳小劍, 饒本強(qiáng), 何曉生, 吳現(xiàn)瑞, 鄒一豐, WALKER Allan, 石海寧△

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸外科, 廣東 廣州 510655; 2哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院黏膜免疫實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)馬薩諸塞州 查爾斯鎮(zhèn) 02129；3廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180)

H. polygyrus感染對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腸病的影響及其作用機(jī)制研究*

李旺林1,2，3, 蘭 平1△, 吳小劍1, 饒本強(qiáng)1, 何曉生1, 吳現(xiàn)瑞1, 鄒一豐1, WALKER Allan2, 石海寧2△

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸外科, 廣東 廣州 510655;2哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院黏膜免疫實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)馬薩諸塞州 查爾斯鎮(zhèn) 02129；3廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180)

目的研究多形螺旋線蟲(H.polygyrus)感染對(duì)CD4+輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病(IBD)的影響及其作用機(jī)制。方法用卵清蛋白(OVA)特異性的CD4+輔助性T細(xì)胞轉(zhuǎn)入重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中制作IBD模型。將IBD小鼠感染H.polygyrus，14 d后處死小鼠，觀察結(jié)腸的組織學(xué)變化，用ELISA法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)中干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)的表達(dá)。另外，對(duì)感染H.polygyrus的IBD小鼠注射IL-4單克隆抗體以阻斷IL-4的分泌，9 d后處死小鼠，觀察相同的指標(biāo)。結(jié)果與無感染組相比，感染H.polygyrus的IBD小鼠結(jié)腸病損明顯加重，腸系膜淋巴結(jié)中IL-4水平明顯增高，IFN-γ水平明顯降低(均Plt;0.05)。在IL-4阻斷實(shí)驗(yàn)中，與無IL-4阻斷組相比，IL-4阻斷組結(jié)腸病損明顯減輕，IL-4水平明顯降低，IFN-γ水平明顯增高(均Plt;0.05)。結(jié)論H.polygyrus感染在CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的IBD模型早期加重了炎癥反應(yīng)，其作用可能是通過誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子的分泌、抑制Th1細(xì)胞因子的分泌來實(shí)現(xiàn)的，提示用蠕蟲治療IBD時(shí)需謹(jǐn)慎。

炎性腸疾?。?多形螺旋線蟲； T淋巴細(xì)胞，輔助性

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases， IBD)是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病， 包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis， UC)和克羅恩病(Crohn’s disease， CD)[1]。它是廣泛影響健康的疾病之一,病理特征是結(jié)腸的黏膜及黏膜下層存在大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及激活CD4輔助T細(xì)胞,自主免疫過度激活,導(dǎo)致嚴(yán)重的透膜性腸道黏膜炎癥,產(chǎn)生大量炎癥因子和趨化因子[2,3]。

近年來，我們已經(jīng)觀察到免疫介導(dǎo)性疾病(包括IBD)的發(fā)病率和寄生蟲感染之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[4]。據(jù)估計(jì)，全世界30億人感染蠕蟲。蠕蟲感染的重要性不僅包括直接的蠕蟲致病作用，而且對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)起調(diào)節(jié)作用，這可能會(huì)改變宿主對(duì)其它抗原的反應(yīng)，并導(dǎo)致另外的免疫病理性損傷。因此，我們構(gòu)建了CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的IBD動(dòng)物模型，并進(jìn)一步研究蠕蟲感染與炎性腸病之間的關(guān)系及其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

選擇6-8周的雌性重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠(SPF 級(jí)), 以高壓蒸汽消毒的食物和水喂養(yǎng)。

2卵清蛋白(ovalbumin,OVA)特異性CD4+T細(xì)胞(KJT細(xì)胞)的提取

用CO2吸入法處死DO11.10小鼠(OVA特異性 T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠)，取出小鼠的外周淋巴結(jié)和脾臟。將外周淋巴結(jié)和脾臟分組研磨(溶液為完全DMEM)，用70 μm的濾器過濾。脾臟組加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，混合、孵育5 min。制備淋巴細(xì)胞懸液，以CD4+T細(xì)胞提純柱提純CD4+T細(xì)胞。

3炎性腸病模型的制作及其監(jiān)測(cè)

用已經(jīng)制備好的來自DO11.10小鼠的OVA特異性CD4+輔助性T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)移進(jìn)入SCID小鼠(5-8×106/鼠)。在蠕蟲感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)入的前1 d，用鏈霉素(267 g/L，75 μL/鼠)處理小鼠。24 h后，口服OVA特異性表達(dá)的E.coli(EOVA,5×109/鼠)。其后，每隔1 d喂養(yǎng)EOVA。將小鼠分為2組，一組感染多形螺旋線蟲(Heligmosoidespolygyus,H.polygyrus200/鼠),記為HP+KJ+EOVA組；另外一組不感染，記為KJ+EOVA組。每天監(jiān)測(cè)臨床癥狀、糞便和體重的變化。評(píng)估結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。

4處死SCID鼠

實(shí)驗(yàn)14 d后，所有小鼠吸入CO2處死。

5結(jié)腸組織HE病理染色

打開腹腔，游離結(jié)腸，再沿縱軸將結(jié)腸切開并在生理鹽水中漂洗，觀察各組大鼠結(jié)腸的大體改變。沿縱軸在近側(cè)結(jié)腸分別剪取3段(上、中、下各1段)；以包埋液包埋，5 μm 連續(xù)切片，蘇木素/伊紅(haematoxylin and eosin, HE)染色。結(jié)腸病理變化采用改進(jìn)的組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分[5]。

6淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)

打開腹腔，取出腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node， MLN)。將外周淋巴結(jié)分組研磨(溶液為cDMEM)，用70 μm的濾器過濾。4 ℃、1 500 r/min離心8 min。離心后棄除上清。加入2 mL 完全DMEM溶液，將細(xì)胞震蕩溶解。取出1×107細(xì)胞數(shù)，將之調(diào)成5×109cells/L 完全DMEM。分別以CD3單克隆抗體和OVA孵育，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi), 5% CO2、37 ℃靜置培養(yǎng)。72 h后，收集培養(yǎng)液上清。置于-20 ℃凍存。以ELISA法檢測(cè)Th1細(xì)胞因子[干擾素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)]和Th2細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素4 (interleukin-4,IL-4)]的表達(dá)量。

7淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子流式細(xì)胞儀檢測(cè)

處死小鼠，取出腸系膜淋巴結(jié)。研磨組織，制備淋巴細(xì)胞懸液。取出1×107細(xì)胞數(shù)，溶解于2 mL 完全DMEM中(5×109cells/L)。加入PMA, 3 μL(200 mg/L)、ionomycin 4 μL (2 g/L)，混勻，37 ℃孵育2 h，再加入brefeldin A 4 μL (5 g/L)孵育2 h。以cytochrome標(biāo)記的CD4單克隆抗體進(jìn)行表面染色，然后用甲醛溶液固定。再加入破膜劑，冰上孵育20 min，然后用PE標(biāo)記的IL-4單克隆抗體、FITC標(biāo)記的IFN-γ單克隆抗體染色。最后再用甲醛固定。以流式細(xì)胞儀(fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS)檢測(cè)染色標(biāo)本。分析數(shù)據(jù)，得出各個(gè)細(xì)胞因子的比例數(shù)據(jù)。

8抗IL-4阻斷實(shí)驗(yàn)

分為3組，分別為：KJ+EOVA組(無H.polygyrus感染)，HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組(有H.polygyrus感染、無抗IL-4阻斷)，HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組(有H.polygyrus感染、有抗IL-4阻斷)。前面2組按前面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處理。HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組，在第1、4、7 d分別用抗IL-4單克隆抗體(50 μg/鼠)進(jìn)行腹腔注射。第9 d將小鼠處死。將結(jié)腸組織進(jìn)行HE病理染色，觀察結(jié)腸病理變化的情況。取出腸系膜淋巴結(jié)，制作淋巴細(xì)胞懸液，以CD3單克隆抗體進(jìn)行孵育，培養(yǎng)48-72 h。收集上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子含量。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1非IL-4阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.1KJ+EOVA組SCID鼠大便偶有稀爛、體重增加、毛發(fā)有光澤，飲食、活 動(dòng)、精神狀態(tài)均基本正常。HP+KJ+EOVA組在5 d后部分小鼠可出現(xiàn)活動(dòng)減少、體重減輕、毛發(fā)無光澤、飲食減少、黏液稀便等。所有實(shí)驗(yàn)小鼠在14 d處死解剖，實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠均未死亡。實(shí)驗(yàn) 14 d時(shí)，KJ+EOVA組小鼠體重增加(0.47±0.56)g；HP+KJ+EOVA組小鼠體重增加(0.45±0.57)g；2組比較無顯著差異，Pgt;0.05。

1.2結(jié)腸組織病理結(jié)果 HP+KJ+EOVA組結(jié)腸黏膜固有層細(xì)胞浸潤(rùn)增多，結(jié)腸上皮破損增加，病理評(píng)分明顯高于對(duì)照組(KJ+EOVA組)，分別為(5.4±0.5)分和(2.1±0.7)分，差異顯著(Plt;0.05)，見圖1、2。

Figure 1. Histological changes of the colon in IBD mice(HE staining,×200). A: KJ+EOVA group; B: HP+KJ+EOVA group.

Figure 2. Histological scores of colons in IBD mice.

1.3MLN細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果 CD3單克隆

抗體刺激的HP+KJ+EOVA組IFN-γ為(2.57±1.28)μg/L,KJ+EOVA組為(12.66±6.32)μg/L,Plt;0.05。 OVA刺激的HP+KJ+EOVA組IFN-γ為(6.47 ±1.57)μg/L,KJ+EOVA組為(12.39±4.10)μg/L,Plt;0.05。 CD3單克隆抗體刺激的HP+KJ+EOVA組IL-4為(0.08±0.09)μg/L,KJ+EOVA組為(0.02 ±0.02)μg/L,Plt;0.05。OVA刺激的HP+KJ+EOVA組IL-4為(0.14 ±0.14)μg/L,KJ+EOVA組未檢出,Plt;0.05，見圖3。

Figure 3. Cytokine production of MLN in IBD mice. A: anti-CD3-stimulated IFN-γ production；B：OVA-stimulated IFN-γ production; C: anti-CD3-stimulated IL-4 production；D：OVA-stimulated IL-4 production±s. *Plt;0.05 vs KJ+EOVA.

1.4MLN細(xì)胞因子流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 KJ+EOVA組IFN-γ(Th1) 的比率為(28.50±0.86)%，HP+KJ+EOVA組為(26.66±0.39)%，2組比較差異顯著(Plt;0.01)。KJ+EOVA組IL-4(Th2) 的比率為(3.26±0.18)%,HP+KJ+EOVA組為(5.70±0.49)%，2組比較差異顯著(Plt;0.01)。KJ+EOVA組中，Th1/Th2 的比率為(8.76±0.43)，HP+KJ+EOVA組為(4.71±0.45)，2組比較差異顯著(n=5,Plt;0.01)，見圖4。

Figure 4. FACS results of MLN cytokine production . A: KJ+EOVA group; B: HP+KJ+EOVA group.

2IL-4阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1KJ+EOVA組SCID鼠大便偶有稀爛、體重增加、毛發(fā)有光澤，飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)均基本正常。HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組在5 d后部分小鼠可出現(xiàn)活動(dòng)減少、體重減輕、毛發(fā)無光澤、飲食減少、黏液稀便等。HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組SCID鼠大便偶有稀爛、體重增加、毛發(fā)有光澤，飲食、活 動(dòng)、精神狀態(tài)均基本正常。所有實(shí)驗(yàn)小鼠在9 d處死解剖，實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠均未死亡。實(shí)驗(yàn)第9 d時(shí)，KJ+EOVA組小鼠體重增加(-0.08±0.85)g；HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組小鼠體重增加(-0.90±0.80)g；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4) 組小鼠體重增加(-0.80±0.45)g；3組之間兩兩比較均無顯著差異，Pgt;0.05。

2.2結(jié)腸組織病理結(jié)果 HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組結(jié)腸與HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，固有層細(xì)胞浸潤(rùn)減少，黏膜上皮破損好轉(zhuǎn)，炎癥情況明顯減輕，差異顯著(Plt;0.05),見圖5、6 。

2.3MLN細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果 CD3單克隆抗體刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IFN-γ為(0.32 ±0.28) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組為(2.74±1.16) μg/L,KJ+EOVA組為(3.52 ±2.44) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。OVA刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IFN-γ為(0.34 ±0.12) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組為(1.82±1.75) μg/L,KJ+EOVA組為(2.53 ±2.19) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，差異無顯著(Pgt;0.05),見圖7A、B。

Figure 5. HE staining of the mouse colon section in IL-4 blocking experiment(×200). A: KJ+EOVA group ; B: HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4) group; C: HP+KJ+EOVA(anti-IL-4) group.

Figure 6. Histological scores of colons in mice in IL-4 blocking experiment.n=4.

CD3單克隆抗體刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IL-4為(0.07 ±0.06) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組為(0.02±0.01) μg/L,KJ+EOVA組為(0.01 ±0.01) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。OVA刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IL-4為(0.08 ±0.04) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組IL-4為(0.01±0.02)μg/L,KJ+EOVA組IL-4為(0.00 ±0.00) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，無顯著差異(n=4，Pgt;0.05),見圖7C、D。

Figure 7. Cytokine production of MLN in IL-4 blocking experiment.A:anti-CD3-stimulated IFN-γ production;B:OVA-stimulated IFN-γ production;C:anti-CD3-stimulated IL-4 production;D:OVA-stimulated IL-4 prodution±s.n=4.*Plt;0.05 vs HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4).

討 論

IBD的發(fā)生由易感基因、環(huán)境因素與免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的交互作用所致，引起非特異性炎癥細(xì)胞激活，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)，引起腸黏膜組織炎癥及病理?yè)p害。隨著遺傳因素、環(huán)境因素、異常的免疫反應(yīng)和機(jī)制的進(jìn)展，IBD的治療發(fā)生了很大改變，腸道微環(huán)境的改善越來越重要。在動(dòng)物模型和人體寄生蟲感染的研究，有大量的信息支持寄生蟲感染在炎癥腸病中的免疫調(diào)節(jié)作用。

蠕蟲是精妙的多細(xì)胞有機(jī)體，伴有復(fù)雜的生活史和發(fā)育史。它們多存在于溫?zé)釟夂?、擁擠、臟亂、食品衛(wèi)生條件差的環(huán)境中。在這種環(huán)境中IBD的發(fā)生率卻很低[4]。宿主通過接觸土壤、食物和被污染的水而感染不同的蠕蟲。兒童更容易感染蠕蟲是因?yàn)樗麄兘?jīng)常會(huì)接觸土壤并且較少注意衛(wèi)生習(xí)慣。蠕蟲能刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)[6]，以此來促進(jìn)排蟲或限制寄生程度。許多蠕蟲可以在宿主腸道、膽道系統(tǒng)、腸系膜靜脈中生存多年。因此，從兒童時(shí)期感染寄生蟲開始，這些蠕蟲或它們的卵釋放的各種因子長(zhǎng)年作用于腸黏膜表面，持續(xù)產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，感染寄生蟲可以阻止或延緩免疫失調(diào)動(dòng)物模型的病情。用三硝基苯磺酸(TNBS)給動(dòng)物灌腸制作Th1型結(jié)腸炎模型，其腸道黏膜炎癥的特點(diǎn)是產(chǎn)生大量IFN-γ及IL-12，在許多以T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)性小鼠結(jié)腸炎模型中，通過應(yīng)用IL-10、IL-4或IL-1中和抗體的治療取得了較好的效果[7-9]。這些都表明結(jié)腸炎動(dòng)物模型與免疫調(diào)節(jié)異常之間有著密切關(guān)系。

估計(jì)全球30億人感染有寄生蟲[10]。在宿主免疫學(xué)研究中，H.polygyrus是一種自然界中的小鼠線蟲，大多寄生于十二指腸。研究結(jié)果表明，H.polygyrus能夠誘發(fā)劇烈的Th2型免疫反應(yīng)[11]，并作為黏膜佐劑，改變宿主對(duì)口服蛋白抗原的反應(yīng)[12，13]。因此，該蠕蟲感染引起了Th2型反應(yīng)的升高，在有H.polygyrus感染小鼠中減少食物抗原的過敏性反應(yīng)[14]。此外，蠕蟲感染驅(qū)動(dòng)的Th2細(xì)胞極化的T細(xì)胞反應(yīng)，與一些Th1細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的改善是相關(guān)的，如Th1型糖尿病與幽門螺桿菌引起的胃炎[15-17]。也有證據(jù)支持：當(dāng)并發(fā)病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染時(shí)，蠕蟲感染引起的免疫反應(yīng)加重[18-21]。雖然蠕蟲感染后導(dǎo)致的Th1/Th2免疫反應(yīng)失衡被認(rèn)為在免疫反應(yīng)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，然而當(dāng)多重感染或者疫苗出現(xiàn)在寄生蟲感染的個(gè)體中時(shí)，寄生蟲和其它病原體之間的相互關(guān)系是比較復(fù)雜的，目前并沒有得到充分的了解。

目前認(rèn)為，結(jié)腸的黏膜及黏膜下層存在大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及激活CD4+輔助T細(xì)胞,由于自主免疫過度激活,導(dǎo)致了IBD的發(fā)生。CD4+T細(xì)胞在炎性腸病的發(fā)病中起著重要作用。我們將OVA特異性的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)入SCID小鼠體內(nèi)，由此誘發(fā)的腸炎更能模擬臨床IBD的發(fā)病過程。目前國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。我們的模型系統(tǒng)包括兩個(gè)能夠誘導(dǎo)自身免疫性疾病和Th反應(yīng)的小鼠腸道感染因素：(1)H.polygyrus-OVA特異性E.coli-KJ T細(xì)胞SICD小鼠模型，其中寄生蟲能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th2反應(yīng)；(2)OVA特異性E.coli-KJ T細(xì)胞SCID小鼠模型，能產(chǎn)生自體免疫疾病。E.coli是一種革蘭陰性桿菌，是正常小鼠的細(xì)菌，能誘導(dǎo)腸道上皮表面病變。這種E.coli具有OVA特異性的抗原，而KJ T細(xì)胞有OVA特異性的受體，這將導(dǎo)致自身免疫性的腸炎。

我們?cè)谔接慔.polygyrus干預(yù)CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)腸炎的效應(yīng)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染H.polygyrus的小鼠加重了CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)的腸炎小鼠結(jié)腸的病理學(xué)損傷。體重變化無明顯差異，可能與我們研究炎性腸病早期階段的變化、實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短有關(guān)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)，感染H.polygyrus組表現(xiàn)為IL-4升高和IFN-γ降低。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子在CD4+T細(xì)胞中的分泌比率，感染H.polygyrus組亦表現(xiàn)為IL-4升高和IFN-γ降低。H.polygyrus感染的SCID小鼠腸炎模型中，腸系膜淋巴結(jié)Th1細(xì)胞分泌受抑，Th2細(xì)胞的分泌增加，說明H.polygyrus的感染可誘導(dǎo)它向Th2方向分化，而抑制它向Th1方向分化。Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ在炎癥早期對(duì)結(jié)腸組織有保護(hù)作用。H.polygyrus可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th2反應(yīng)，通過Th1/Th2平衡，抑制Th1反應(yīng)，降低了IFN-γ的分泌，從而導(dǎo)致IFN-γ對(duì)結(jié)腸組織保護(hù)性的減低，加重了結(jié)腸病理性損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其它一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果不太一致，可能跟我們研究炎性腸病早期階段的變化、實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短有一定關(guān)系。但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣可以提醒我們，在用寄生蟲對(duì)炎癥性腸病治療時(shí)，需要謹(jǐn)慎。對(duì)蠕蟲在炎性腸病中的效應(yīng)作用和機(jī)制還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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TheeffectandmechanismofH.polygyrusinfectioninT-cell-mediatedinflammatoryboweldiseaseinmice

LI Wang-lin1,2,3, LAN Ping1, WU Xiao-jian1, RAO Ben-qiang1, HE Xiao-sheng1, WU Xian-rui1, ZOU Yi-feng1, WALKER Allan2, SHI Hai-ning2

(1DepartmentofColorectalSurgery,TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;2MucosalImmunologyLaboratory,MassachusettsGeneralHospital,HarvardMedicalSchool,CharlestownMA02129,USA;3FirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China.E-mail:LWL3132008@sina.com)

AIM: To investigate the effect and mechanism ofHeligmosomoidespolygyrus(H.polygyrus) infection in mouse inflammatory bowel disease (IBD) mediated by CD4+helper T-cells.METHODSOvalbumin (OVA) -specific CD4+helper T-cells were transferred into SCID (severe combined immunodeficiency) mice to establish an IBD model. The IBD mice were infected byH.polygyrusand sacrificed 14 days later. The histological changes of the colon were observed, and the expression of interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) in mesenteric lymph nodes was detected by ELISA and flow cytometry. Additionally, IL-4 monoclonal antibody was intraperitoneally injected into theH.polygyrus-infected IBD mice to block the secretion of IL-4. The IL-4-blocking IBD mice were sacrificed 9 days later and the above indexes were also determined.RESULTSCompared with the non-infection group, theH.polygyrus-infected IBD mice had more severe colonic lesions, higher level of IL-4 and lower level of IFN-γ in mesenteric lymph nodes (allPlt;0.05). Compared with the non-blocking group, theH.polygyrus-infected IBD mice with IL-4 blockage had less colonic lesions, lower IL-4 level and higher IFN-γ level (allPlt;0.05).CONCLUSIONH.polygyrusinfection in CD4+T-cell-mediated IBD model promotes inflammation in the early stage probably by inducing the secretion of Th2 cytokine and inhibiting the secretion of Th1 cytokine. The finding suggests that using worms for treatment of IBD needs to be cautious.

Inflammatory bowel diseases;Heligmosomoidespolygyrus; T-lymphocytes, helper-inducer

1000-4718(2011)04-0732-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.021

2010-12-10

2011-02-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30872461) ；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 8151008901000107)

△通訊作者 Tel:020-81085322;E-mail: LWL31312008@sina. com