劉艷霞， 劉佳妮， 沈明志， 李 榕， 張榮懷， 翟雅莉， 趙 萌， 王躍民， 王曉明△

(第四軍醫(yī)大學(xué)1西京醫(yī)院老年病科，2生理學(xué)教研室,陜西 西安710032)

EDRV和DIDS對(duì)急性缺血再灌注心肌組織活性氧水平的影響*

劉艷霞1， 劉佳妮1， 沈明志1， 李 榕1， 張榮懷1， 翟雅莉1， 趙 萌1， 王躍民2， 王曉明1△

(第四軍醫(yī)大學(xué)1西京醫(yī)院老年病科，2生理學(xué)教研室,陜西 西安710032)

4, 4’-二異硫氰基芪-2, 2’-二磺酸； 再灌注； 活性氧；依達(dá)拉奉；心臟

心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injuury,I/RI)的主要機(jī)制是活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，其主要來(lái)源于線粒體的黃嘌呤氧化酶、吞噬細(xì)胞和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotine adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH oxidase)[1]。ROS是誘導(dǎo)組織細(xì)胞損傷性死亡的關(guān)鍵分子。研究表明：用抗氧化劑治療或者上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶可以保護(hù)再灌注引起的損傷；轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗氧化蛋白質(zhì)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)的高表達(dá)時(shí)心肌梗死面積可顯著減少[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，氯離子通道阻斷劑 4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸( 4,4’- diisothiocyanostilbene-2, 2’-disulfonic acid ,DIDS)具有減輕心臟I/RI的作用[3-5]，且發(fā)現(xiàn)DIDS 、自由基清除劑依達(dá)拉奉(edaravone,EDRV)及兩者聯(lián)合使用均具有保護(hù)心肌的作用，那么，他們是通過什么途徑起作用的？對(duì)組織中ROS有調(diào)節(jié)作用嗎？作用機(jī)制如何？為此，本研究進(jìn)行了上述問題的實(shí)驗(yàn)觀察。

材 料 和 方 法

1材料

2方法

2.1心肌I/RI模型的制備及實(shí)驗(yàn)方案 將SD大鼠以30 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，按常規(guī)方法制備大鼠I/RI(30 min/4 h)模型[6]：頸正中切口氣管插管，連接呼吸機(jī)進(jìn)行正壓人工呼吸，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至左心室記錄左室壓及其微分。開胸暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支起始段，以心電圖上ST段抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志。缺血30 min后，松開絲線，再灌注4 h。將40只SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)(sham)組、心肌I/RI組、DIDS(I/RI+DIDS)組、EDRV組(I/RI+EDRV)組和DIDS+EDRV(I/RI+DIDS+EDRV)組，每組8只大鼠。于再灌注前，將EDRV按10 mg/kg經(jīng)右頸動(dòng)脈注入，持續(xù)注入時(shí)間為5 min[7]。于再灌注即刻,經(jīng)股靜脈以程控微量泵給予DIDS(14 mg/kg,4 mL·kg-1·h-1),持續(xù)2 h[3]。

2.2心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組心肌組織中的凋亡細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，樣本切片在 1 h 內(nèi)(避免熒光淬滅)于熒光顯微鏡下觀察。本實(shí)驗(yàn)采用 Hoechst 33342 對(duì)全部細(xì)胞核進(jìn)行襯染。

2.3血清SOD活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的檢測(cè) 再灌注 4 h 結(jié)束時(shí),從大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈取血 2 mL,室溫放置30 min 后,3 000 r/min 離心20 min后用移液器取上清分裝在 EP 管中，盡量避免傾倒，液氮速凍，-20 ℃ 冰箱保存。按照試劑盒說明書操作，用分光光度計(jì)檢測(cè)SOD 活性及 MDA 含量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定

TUNEL法檢測(cè)不同組大鼠I/R 4h心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果見圖1、表1。與sham組相比，其它 4 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于sham組(Plt;0.05)；與I/RI組相比，DIDS組、EDRV組與DIDS + EDRV組的心肌細(xì)胞凋亡均明顯降低(Plt;0.05)，DIDS和EDRV組間無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，DIDS + EDRV組較DIDS或EDRV組有明顯降低(Plt;0.05)，可見DIDS和EDRV均具有抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用，聯(lián)合使用時(shí)，其抑制作用強(qiáng)于二者單獨(dú)使用。

Figure 1. Effects of EDRV or/and DIDS on myocardial apoptosis in acute ischemia- reperfusion injury.

表1 DIDS和EDRV及二者聯(lián)合使用對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

2血清SOD活性及MDA含量的檢測(cè)

不同組大鼠I/RI 4 h血清SOD活性及MDA含量見圖2、3，I/RI 組、DIDS 組、EDRV 組及 DIDS + EDRV 組血清中 SOD 活性較sham 組明顯降低，但 MDA 含量較 sham 組明顯增加(Plt;0.05)；與 I/RI 組比，DIDS 組、EDRV 組及 DIDS + EDRV 組血清中 SOD 活性均明顯增加(Plt;0.05)，但MDA 含量均明顯降低(Plt;0.05)； DIDS 組與 EDRV 組相比，DIDS 組的 SOD 活性降低更顯著(Plt;0.05), 但MDA 含量增高更顯著(Plt;0.05)；而DIDS + EDRV組與 EDRV 組相比，DIDS + EDRV 組的 SOD 活性明顯增高，但MDA 活性明顯降低，但均無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)。

Figure 2. Effects of EDRV and DIDS on serum SOD activity after acute ischemia- reperfusion injury ±sE. n=8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 3. Effects of EDRV and DIDS on serum MDA concentration after acute ischemia- reperfusion injury ±sE. n =8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 4. Effects of EDRV and DIDS on ROS concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE. n =8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 5. Effects of EDRV and DIDS on superoxide anion concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE. n=8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 6. Effects of EDRV and DIDS on hydroxy free radical (OH·) concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE.n=8.*Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

討 論

氯離子是體內(nèi)最豐富的陰離子，其調(diào)節(jié)主要受細(xì)胞膜上特異通道蛋白的功能性改變相關(guān)，它參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、發(fā)育、凋亡及細(xì)胞容積的變化等重要生理功能。我們前期從細(xì)胞及整體動(dòng)物水平已經(jīng)證實(shí)了氯離子通道阻斷劑DIDS能夠抑制I/RI心肌細(xì)胞的凋亡及改善心臟功能[3-5,9]，其保護(hù)心肌細(xì)胞與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[4， 5]。眾多研究證實(shí)I/RI是缺血性心血管疾病血管再通后加重組織器官損傷的主要機(jī)制，而活性氧的產(chǎn)生是引起細(xì)胞損傷的主要啟動(dòng)因子[1]。Qin等[8]報(bào)道梗死后心肌缺血/再灌注損傷與壞死區(qū)周圍組織中細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，用抗氧化劑治療或者上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶可有效保護(hù)再灌注引起的心肌損傷。同時(shí)，我們前期的研究也證實(shí)：在急性缺血/再灌注大鼠模型的再灌注前給予 ROS 清除劑-EDRV，能夠改善心臟功能，減小缺血/再灌注損傷心肌凋亡的發(fā)生，進(jìn)一步證明了活性氧簇在心臟缺血/再灌注損傷中的重要作用。

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EffectsofEDRVandDIDSonreactiveoxygenspecieslevelsinacuteischemia-reperfusioninjuredmyocardium

LIU Yan-xia1, LIU Jia-ni1, SHEN Ming-zhi1, LI Rong1, ZHANG Rong-huai1, ZHAI Ya-li1, ZHAO Meng1, WANG Yue-min2, WANG Xiao-ming1

(1DepartmentofGeriatrics,XijingHospital,2DepartmentofPhysiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:xmwang@fmmu.edu.cn)

4,4’-diisothiocyanostilbene-2, 2’-disulfonic acid; Reperfusion; Reactive oxygen species; Edaravone; Heart

1000-4718(2011)04-0648-05

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.005

2010-10-02

2011-02-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.30770847; No.81070127)

△通訊作者 Tel:029-84775543;E-mail:xmwang@fmmu.edu.cn