殷建瑞, 張 波, 譚麗華, 傅 賢, 魏 歡, 李 玲

(1廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 510260； 2昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051；3中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510080)

丁苯酞對缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細胞VEGF和 HIF-1α表達的影響*

殷建瑞1, 張 波1, 譚麗華1, 傅 賢1, 魏 歡2, 李 玲3△

(1廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 510260；2昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051；3中山大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510080)

目的探討丁苯酞(NBP)保護缺氧缺糖(OGD)細胞損傷的機制。方法對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)予以O(shè)GD損傷，MTT法檢測細胞活性；Hoechst 33342染色檢測細胞核形態(tài)；免疫熒光法觀察血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達，IPP軟件分析熒光強度，進行定量分析;Western blotting檢測加以驗證。結(jié)果NBP在0.01- 10 μmol/L濃度之間劑量依賴性減少了OGD導致的細胞活性下降和細胞核形態(tài)改變。NBP促進了OGD后HUVECs內(nèi)VEGF和HIF-1α的表達，均高于OGD組，熒光定量分析差異顯著。兩者表達的高峰分別為OGD后6 h和8 h。結(jié)論NBP可以促進內(nèi)皮細胞在缺氧缺糖條件下HIF-1α的表達，從而引起下游VEGF的表達增多，最終保護內(nèi)皮細胞免受缺氧缺糖損傷。

丁苯酞; 血管內(nèi)皮細胞; 缺氧缺糖; 血管內(nèi)皮生長因子; 缺氧誘導因子-1

左旋丁基苯酞又名芹菜甲素，是從芹菜種籽中分離出的有效成分，根據(jù)它的結(jié)構(gòu)式，其異構(gòu)體右旋丁基苯酞被合成出來。之后它們的混合物消旋丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)作為臨床藥物被發(fā)展起來，也稱為丁苯酞[1]。 大量的研究證實NBP在治療腦卒中和其它一些疾病中具有良好效果，而且發(fā)現(xiàn)其可能通過多種途徑發(fā)揮保護作用，如改善供血、保護血腦屏障、抗血栓形成、抗炎癥、改善線粒體功能失調(diào)等[2-4]。然而，NBP發(fā)揮保護作用的具體機制并非完全清楚。闡明NBP對細胞的具體保護機制，可以對NBP進行改進和發(fā)展，使此藥能夠更加有效地發(fā)揮保護作用。

材 料 和 方 法

1細胞培養(yǎng)和試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)(購自上海晶賽公司)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、90%濕度、含 5% CO2和 95% 空氣(V/V) 的培養(yǎng)箱中。

NBP(石家莊恩必普藥業(yè)有限公司贈送,99.9%臨用前使用溶劑DMSO)溶解，再使用細胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。NBP的最終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L。在溶劑對照組中只單獨加入溶劑。

2缺氧缺糖(oxygen-glucosedeprivation,OGD)細胞模型

將內(nèi)皮細胞種植于各種規(guī)格的培養(yǎng)皿，先培養(yǎng)24 h。在NBP處理組將培養(yǎng)液換成含有不同濃度NBP的無糖DMEM培養(yǎng)液(其中含0.2%DMSO)，在溶劑處理組換為僅含有0.2%DMSO的無糖DMEM培養(yǎng)液，再培養(yǎng)30 min。之后細胞被放置于持續(xù)充以95%N2+ 5%CO2混合氣體的密封低氧槽中，根據(jù)不同實驗所需，在37 ℃條件下的細胞培養(yǎng)箱中溫育所需時間。 當OGD結(jié)束，在移入正常氧壓條件前，將培養(yǎng)液換成含有相同濃度NBP或者DMSO的正常培養(yǎng)基。在正常對照組，細胞接受除了無糖培養(yǎng)基或者缺氧處理之外的所有實驗操作步驟。

3細胞活性測定

依照測試盒中廠家提供的說明書來測定細胞活性。在OGD結(jié)束時，每個細胞培養(yǎng)孔中加入100 μL 0.5 g/L MTT，置于37 ℃、90%濕度、含 5% CO2和 95% 空氣(V/V)的培養(yǎng)箱中4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄培養(yǎng)液，每個孔中加入100 μL溶媒。最后，在酶聯(lián)免疫儀上，570 nm波長測定各孔吸光度值(A570)。由于只有活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為難溶性藍紫色結(jié)晶物，故各孔A570的變化可間接反映活細胞數(shù)量。所有結(jié)果來自5次獨立實驗，每次實驗中設(shè)3個平行組。

4Hoechst染色

使用Hoechst 33342對OGD后HUVECs進行染色，以檢測OGD后細胞核形態(tài)的變化。在4孔板中培育細胞，直至生長融合85%左右，在暴露于OGD后，每個培養(yǎng)孔中加入1 μL Hoechst 33342(5 g/L，Sigma)和1 mL的培養(yǎng)基，培育30 min。使用PBS溶液對染色細胞沖洗2次，然后在熒光顯微鏡下進行觀察。為定量分析細胞核形態(tài)變化，具有異常胞核的細胞百分數(shù)被計數(shù)。在10幅隨機挑選的40倍放大顯微鏡視野中的所有細胞均被計數(shù)。所有結(jié)果來自5次獨立實驗，每次實驗中設(shè)3個平行組。

5免疫熒光

將生長于蓋玻片上的HUVECs使用新鮮配制的4%多聚甲醛(pH 7.4)固定20min，PBS洗凈，使用含1% Triton X-100的PBS破膜30 min，PBS洗凈。含5%驢血清的PBS封閉非特異性結(jié)合位點30 min，使用以下的Ⅰ抗孵育細胞1 h：兔來源抗內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體(chemicon)，老鼠抗缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)抗體(Abcam)，(所有Ⅰ抗均使用3%BSA/PBS 按1∶500稀釋)這些結(jié)合的Ⅰ抗通過與FITC標記的驢抗兔Ⅱ抗和TR標記的驢抗鼠Ⅱ抗孵育后進行檢測(所有Ⅱ抗均使用3%BSA/PBS 按1∶1 000稀釋)。PBS沖洗干凈后，所有玻片均通過倒置顯微鏡進行計數(shù)和分析。所有的熒光圖片均在同樣的曝光條件下進行拍攝。為進行核計數(shù)染色，所有的細胞均在染色后使用10 g/L DAPI孵育10 min。使用IPP軟件分析熒光強度。所有結(jié)果來自5次獨立實驗，每次實驗中設(shè)3個平行組。

6免疫印跡(Westernblotting)檢測VEGF和HIF-1α蛋白表達

處理后的細胞使用PBS洗凈，使用含PMSF的細胞裂解液冰上裂解30 min，13 000×g離心10 min(4 ℃)，收集上清。按照說明以BCA-100蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%積層膠和8%分離膠進行跑膠，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，含5%脫脂牛奶的TBS-T封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。TBS-T洗凈，Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，TBS-T洗凈。使用超敏反應(yīng)盒進行曝光、拍片。

7統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1NBP劑量依賴性地減少了OGD導致的細胞損傷

通過MTT法和觀察細胞核形態(tài)來評估細胞活性。與溶劑對照組相比，在0.01-100 μmol/L濃度之間NBP并不影響HUVECs的細胞活性。OGD處理8 h后，溶劑處理組的相對MTT值是50%，而10 μmol/L NBP組大約為80%，見圖1。在0.01-10 μmol/L濃度之間，NBP劑量依賴性地抑制了OGD導致的MTT值下降，見圖1。然而10 μmol/L與 100 μmol/L之間的作用無顯著差異，說明當NBP的濃度達到10μmol/L時已經(jīng)是作用的飽和濃度，超過10 μmol/L的濃度不會提高其保護效果。

Figure 1. NBP significantly prevents OGD-induced decrease of viability of HUVECs in a dose-dependent manner. s.n=5.*Plt; 0.05 vs normal control; #Plt;0.05 vs OGD+vehicle.

在細胞核形態(tài)學分析中，我們也觀察到了同樣的結(jié)果。在OGD處理后出現(xiàn)了核皺縮和核聚集等形態(tài)學變化，而這種形態(tài)變化在正常細胞中基本是未見的。我們使用NBP預(yù)處理后，顯著減少了這種形態(tài)學變化，見圖2。

2NBP對OGD作用后VEGF表達的影響

在正常培養(yǎng)條件下，免疫熒光幾乎檢測不到HUVECs內(nèi)VEGF的表達，但經(jīng)過OGD處理8 h后HUVECs的VEGF表達量明顯升高，主要在細胞胞漿中表達，較均勻分布。在OGD+NBP組中，細胞內(nèi)VEGF生成的量得到更進一步的升高，熒光強度更高，且有表達聚集的現(xiàn)象，見圖3。使用IPP圖像分析軟件進行定量分析，可確定3組間的VEGF表達具有明顯差異，見圖3。 Western blotting可以觀察到相同的蛋白表達趨勢，見圖3。

Figure 2. NBP significantly prevents OGD-induced changes of nuclear morphology in cultured HUVECs(Hoechst 33342 staining,×200). There were visible crenation of nuclei (B1,×600) and condensation of chromatin (B2,×600) in HUVECs after OGDtreatment(marked with arrows, B), which were less visible in control cells (A) and obviously improved in the cells pretreated with NBP (10 μmol/L) (C). ±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control; #Plt;0.05 vs OGD +vehicle.

Figure 3. NBP enhances OGD-induced expression of VEGF.A:digital photomicrograph under fluorescent illumination showed the expression of VEGF was mainly in the cytoplasm(×400). B:bar graph showing the average quantitative optical density of VEGF obtained through IPP analysis. The VEGF level was indicated by the value of optical density over the area with fluorescent. C:Western blotting detected the same results. ±s.n=5 *Plt;0.05 vs normal control; #Plt; 0.05 vs OGD +vehicle.

3NBP促進了OGD導致的HIF-1α表達和其在核內(nèi)的聚集

在正常的培養(yǎng)條件下，幾乎檢測不到HUVECs內(nèi)HIF-1α的表達，OGD處理6 h后, HUVECs核內(nèi)的HIF-1α表達明顯增高。在OGD+NBP組中，HIF-1α的免疫熒光強度較單獨的OGD處理明顯增加，而且聚集在細胞核的位置，見圖4。使用IPP圖像分析軟件進行定量分析，可確定3組間的HIF-1α表達差異顯著，見圖4。Western blotting可以觀察到相同的蛋白表達趨勢,見圖4。

Figure 4. NBP enhances OGD-induced expression of HIF-1α. A:digital photomicrograph under fluorescent illumination showed the expression of HIF-1α was overlapped with the stain of nuclei (×400). B:bar graph showing the average quantitative optical density of HIF-1α obtained through IPP analysis. The HIF-1α level was indicated by the value of optical density over the area with fluorescent.C:Western blotting detected the same results. ±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control;#Plt;0.05 vs OGD +vehicle.

討 論

大量的研究報道了NBP的積極保護作用[2,6]。在本研究中，我們同樣觀察到NBP對缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細胞的保護作用。雖然發(fā)現(xiàn)了如此多的保護作用，但這些結(jié)果僅僅揭示了表面現(xiàn)象，我們對于NBP保護缺血腦組織的確切機制并不清楚。

血管內(nèi)皮細胞在血管再生和血管形態(tài)、功能維持中具有重要地位。我們既往的研究發(fā)現(xiàn) NBP可以通過增加腦內(nèi)微血管數(shù)目和逆轉(zhuǎn)其結(jié)構(gòu)改變，從而達到有效減少寒潮時雙腎雙夾高血壓大鼠模型(stroke-prone renovascular hypertensive rats ，RHRSP)腦卒中發(fā)生及減輕腦損害[5]。研究結(jié)果提示NBP可能作用于血管內(nèi)皮細胞，從而達到預(yù)防腦卒中發(fā)生的作用，這為我們探索NBP保護作用的具體機制提供了線索。之后發(fā)表的相關(guān)研究[7]報道NBP可以促進局灶缺血腦組織和短暫缺血腦組織中VEGF的表達，VEGF是一種促進血管形成和分化的重要調(diào)節(jié)因子，同時具有神經(jīng)保護特性[8]。綜合分析發(fā)表的研究，我們推測NBP可能通過促進血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達進一步促進血管再生，從而發(fā)揮保護作用。

VEGF蛋白既可表達于血管內(nèi)皮細胞，也可表達于多種神經(jīng)組織細胞[9]，之前的研究并未闡明NBP主要是促進何種細胞大量表達VEGF。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)NBP可以促進OGD條件下血管內(nèi)皮細胞中VEGF的表達。與正常氧壓條件相比較，OGD促進了血管內(nèi)皮細胞胞漿中VEGF的表達，經(jīng)過NBP處理后，VEGF的總量得到進一步提高。這一結(jié)果與既往大鼠體內(nèi)研究是一致的[7]，同時也揭示了NBP可以直接促進血管內(nèi)皮細胞大量表達VEGF，從而發(fā)揮自分泌作用。

VEGF表達的上游受到多種因子調(diào)節(jié)，為更深入闡明NBP的作用機制，我們進一步探討了NBP促進VEGF表達的上游通路。既往研究表明在缺氧條件下HIF-1α可促進血管的再生[10]，而HIF-1α也可作為調(diào)節(jié)因子促進下游VEGF的表達[11]。本研究中我們探討了NBP是否可以通過上調(diào)HIF-1α從而達到促進VEGF的表達。實驗結(jié)果表明，在缺氧條件下HIF-1α的表達增多而且在細胞核內(nèi)聚集，NBP可進一步促進這種變化。這一結(jié)果與我們觀察到的NBP促進缺氧條件下VEGF變化趨勢是一致的。基于HIF-1α對VEGF表達的重要調(diào)節(jié)作用，我們推測NBP通過上調(diào)HIF-1α，從而最終促進了VEGF的表達，兩者表達的最高峰分別出現(xiàn)在OGD后6h和8h，也支持HIF-1α是NBP促進VEGF表達的重要上游通路。

NBP不僅促進了血管內(nèi)皮細胞中HIF-1α、VEGF的表達，也提高了血管內(nèi)皮細胞對缺氧的耐受性，增加了缺氧條件下細胞的存活。既往研究表明在多種損傷條件下，HIF-1α在保護細胞存活中發(fā)揮著重要作用[12]。同時VEGF對細胞也具有良好的保護作用[13]。所以NBP可以促進缺氧條件下HIF-1α的穩(wěn)定和聚集，從而直接保護血管內(nèi)皮細胞免受缺氧損傷。NBP也可間接通過HIF-1α下游的VEGF產(chǎn)生對血管內(nèi)皮細胞的保護作用。

綜上所述，我們認為NBP可以促進血管內(nèi)皮細胞在缺氧條件下HIF-1α的表達和在細胞核內(nèi)的聚集，從而增加下游VEGF的表達，并保護血管內(nèi)皮細胞免受缺氧損傷。血管內(nèi)皮細胞分泌的VEGF可作用于細胞自身的VEGF抗體，促進血管再生和血管形態(tài)功能的保存，最終達到預(yù)防和治療腦卒中的作用。

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EffectsofNBPonexpressionofVEGFandHIF-1αinHUVECsundertheconditionofoxygen-glucosedeprivation

YIN Jian-rui1, ZHANG Bo1, TAN Li-hua1, FU Xian1, WEI Huan2, LI Ling3

(1DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510260,China;2Yan’anHospital,Kunming650051,China;3DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:bozhang.1982 @yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the mechanism that dl-3-n-butylphthalide (NBP) protects cells from the induced by oxygen-glucose deprivation (OGD).METHODSHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were exposed to OGD to induce endothelial damage. Endothelial injury was assessed by measuring the changes of chromatin morphology and MTT method. The protein levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hypoxia inducible factor-1 alpha (HIF-1α) were determined by immunofluorescence and quantitatively analyzed with the software IPP. Western blotting was applied to verify the results.RESULTSNBP at the concentrations of 0.01 to 100 μmol/L dose-dependently protected against OGD-induced cell damage. Compared with OGD group, NBP enhanced OGD-induced the expression of VEGF and HIF-1α, and the difference was statistically significant. The expression of VEGF and HIF-1α reached to the peak at the time points of 6 h and 8 h after OGD, respectively.CONCLUSIONUnder the condition of OGD, NBP enhances the expression of HIF-1α in HUVECs, subsequently promotes the expression of downstream VEGF, and eventually elevates the survival of the cells.

dl-3-n-Butylphthalide; Vascular endothelial cells; Oxygen-glucose deprivation; Vascular endothelial growth factors; Hypoxia inducible factor-1

1000-4718(2011)04-0643-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.004

2010-09-09

2011-03-03

廣東省科技計劃資助項目(No.2008B080703029)；廣東省科技計劃資助項目(No.2010B080701008)；國家自然科學基金資助項目(No.81071069)

△通訊作者 Tel：020-34153252; E-mail: bozhang.1982 @yahoo.com.cn