孫建新，王 忠，呂曉敏(新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，烏魯木齊830011)

[本文編輯] 蘭 芬

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂疾病，伴有因胰島素分泌和作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝異常[1]。近年來(lái)，糖尿病發(fā)病率急劇增加，為了更深入地研究糖尿病的作用機(jī)制以及篩選、研發(fā)新藥物，制備一個(gè)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型至關(guān)重要。目前，制備糖尿病動(dòng)物模型主要有4種方法，即化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法、動(dòng)物胰腺部分切除法、轉(zhuǎn)基因法和遺傳法。本研究采用四氧嘧啶(alloxan，ALX)誘導(dǎo)法制備2型糖尿病小鼠模型，考察了誘導(dǎo)過(guò)程中各因素對(duì)小鼠模型的血糖的影響，從而確定制備2型糖尿病小鼠模型的最佳方案。

1 材料和方法

1.1 材料 290只雄性昆明種小鼠，體重18～35g，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(新)2003－0001。Onetouch Ultra Easy穩(wěn)豪型血糖儀和血糖試紙[強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器材有限公司]；AL204型電子分析天平[梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司]；ALX(分析純，美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 ALX劑量的影響實(shí)驗(yàn) 取120只體重為18～22g的小鼠，以隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組和A、B、C、D、E 5個(gè)模型組，每組各20只，放入水沖式飼養(yǎng)籠具中飼養(yǎng)。夜間禁食不禁水，12h后，按10ml／kg體重的劑量，正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水；A、B、C、D、E模型組分別腹腔注射濃度為250、200、150、100、50mg／kg的ALX水溶液[2]。注射后48h內(nèi)灌胃給予10%葡萄糖水溶液(灌胃容積為20ml／kg)，以防止小鼠因低血糖死亡[3]。自注射ALX后72h開(kāi)始禁食12h，尾靜脈取血，用血糖試紙測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，將FBG≥11.1mmol／L的小鼠作為造模成功，計(jì)算成模率與死亡率[4]。成模率(%)＝(造模成功的小鼠數(shù)／存活小鼠數(shù))×100%，死亡率(%)＝(死亡小鼠數(shù)／20)×100%。

1.2.2 不同體重的影響實(shí)驗(yàn) 取體重為18～22.0g、22.1～28.0g、28.1～35.0g的小鼠各20只，分別作為低、中、高體重組。按1.2.1項(xiàng)下的方法，以150mg／kg的ALX誘導(dǎo)造模，測(cè)量FBG，計(jì)算成模率和死亡率[5]。

1.2.3 禁食時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn) 選取體重為18～22g的小鼠50只，按1.2.1項(xiàng)下的飼養(yǎng)和造模方法，腹腔注射150mg／kg的ALX誘導(dǎo)造模。造模72h后以隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，各組小鼠于第4天22：00開(kāi)始，分別禁食不禁水8、10、12、14、16h，測(cè)量FBG，計(jì)算平均值。測(cè)定FBG后，脫頸椎處死小鼠，解剖查看胃腸道排空情況。

1.2.4 墊料的影響實(shí)驗(yàn) 選取體重為18～22g的小鼠60只，以隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和模型組各30只。按1.2.1項(xiàng)下的方法，模型組小鼠腹腔注射150mg／kg的ALX誘導(dǎo)造模。造模后72h，以隨機(jī)數(shù)字表法將模型組小鼠分成A、B、C三組，正常組小鼠分成a、b、c三組，每組10只。其中A組和a組小鼠放入水沖式籠具(無(wú)墊料)中飼養(yǎng)，B組和b組小鼠放入更換新墊料的塑料籠具中飼養(yǎng)，C組和c組小鼠放入不更換墊料的塑料籠具中飼養(yǎng)。各組小鼠于第4天22：00開(kāi)始，禁食不禁水12h后測(cè)量FBG。計(jì)算各組小鼠的FBG平均值，比較組間差異。

1.2.5 小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取1.2.1項(xiàng)下正常對(duì)照組和1.2.4項(xiàng)模型C組小鼠各10只，在檢測(cè)FBG后，立即脫頸椎處死，解剖小鼠，取胰腺組織，以10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀(guān)察小鼠胰腺組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.2.6 模型小鼠FBG的變化規(guī)律 對(duì)1.2.4項(xiàng)下的小鼠，每周禁食不禁水12h，測(cè)量FBG，計(jì)算平均值，連續(xù)5周，觀(guān)察小鼠的FBG變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示。多組間差異采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALX劑量對(duì)小鼠FBG的影響 5個(gè)不同劑量的ALX誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的成模率、死亡率和FBG見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，隨著給藥量的增加，成模率逐漸升高，但小鼠的死亡率也隨之升高?？紤]需要對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期觀(guān)察，權(quán)衡成模率和死亡率，建議ALX的給藥量控制為100～150mg／kg。

表1 不同劑量的四氧嘧啶對(duì)糖尿病小鼠模型成模率、死亡率和空腹血糖的影響Table 1 Effects of different doses of alloxan on successful modelization rate，mortality and fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s)

表1 不同劑量的四氧嘧啶對(duì)糖尿病小鼠模型成模率、死亡率和空腹血糖的影響Table 1 Effects of different doses of alloxan on successful modelization rate，mortality and fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較

組別 四氧嘧啶劑量(ρB／mg·kg－1)成模率(%)死亡率(%)空腹血糖(cB／mmol·L－1)正常對(duì)照組0 0 0 5.09±1.75模型組 250 100 30 32.11±3.52＊＊200 95 15 30.43±6.23＊＊150 90 5 25.57±5.56＊＊100 75 0 21.67±5.75＊50 40 0 11.88±6.54＊

2.2 小鼠體重對(duì)FBG的影響 高、中、低體重組分別有1、3、5只小鼠死亡，有12、17、19只小鼠造模成功，造模成功率分別為60%、85%和95%，F(xiàn)BG分別為(18.03±2.56)、(25.00±3.23)和(32.06±3.52)mmol／L(n＝20)。中、高體重組小鼠的FBG值與低體重組有顯著性差異(P＜0.05)。小鼠出生后，隨著生長(zhǎng)發(fā)育，身體各項(xiàng)機(jī)能逐步完善，胰腺也逐步發(fā)育成熟，對(duì)藥物的耐受性逐步增強(qiáng)。低體重組小鼠由于FBG值太高，糖尿病癥狀加重，在實(shí)驗(yàn)后期容易死亡。體重在22.1～28.0g的小鼠較適合用于制備2型糖尿病模型。

2.3 禁食時(shí)間對(duì)小鼠FBG的影響 不同禁食時(shí)間的小鼠的胃腸道排空情況和FBG測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，小鼠禁食時(shí)間越長(zhǎng)，胃腸道內(nèi)殘留的食物就越少，F(xiàn)BG值就不斷降低，F(xiàn)BG最穩(wěn)定的時(shí)間是在禁食后12～14h。

2.4 墊料對(duì)小鼠FBG的影響 正常組a、b、c組小鼠的FBG值分別為(5.23±1.75)、(5.86±2.45)和(7.24±5.85)mmol／L；模型組A、B、C 組小鼠的FBG值分別為(24.22±2.75)、(26.35±4.55)和(29.89±6.15)mmol／L。有墊料籠具中飼養(yǎng)的小鼠的FBG值比無(wú)墊料籠具中飼養(yǎng)的小鼠的FBG值要高許多(P＜0.01)，而且組內(nèi)差異也很顯著?？紤]到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議使用無(wú)墊料的水沖式籠具飼養(yǎng)糖尿病小鼠模型。

表2 禁食時(shí)間對(duì)糖尿病小鼠模型空腹血糖的影響Table 2 Effects of fasting time on fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝10，±s)

表2 禁食時(shí)間對(duì)糖尿病小鼠模型空腹血糖的影響Table 2 Effects of fasting time on fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝10，±s)

＊P＜0.05，與禁食16h比較

禁食時(shí)間(t／h)胃腸道排空情況平均空腹血糖(cB／mmol·L－1)8少量排空 25.82±6.36＊10 一半排空 24.61±5.22＊12 大部分排空 20.46±4.86＊14 基本排空 19.38±4.36＊16 全部排空14.20±5.46

2.5 小鼠胰腺組織形態(tài)的改變 正常對(duì)照組和模型C組小鼠的胰腺組織形態(tài)圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型C組小鼠的胰腺組織結(jié)構(gòu)散亂，胰島細(xì)胞數(shù)目減少伴萎縮，部分B細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒致密程度降低，呈現(xiàn)透亮。

圖1 小鼠的胰腺組織形態(tài)圖(HE染色，×400)Figure 1 Morphological photographs of pancreatic tissues of mice(HE staining，×400)

2.6 糖尿病小鼠模型的FBG的動(dòng)態(tài)變化 連續(xù)5周監(jiān)測(cè)對(duì)照組和模型組小鼠的FBG，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的FBG由第1周開(kāi)始上升，第2周上升到最高值，第3周時(shí)下降到最低值，但仍＞11.1mmol／L。隨后兩周FBG不斷回升，雖有較小波動(dòng)，但相對(duì)穩(wěn)定。在1～5周內(nèi)模型組和正常對(duì)照組小鼠的FBG均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 糖尿病小鼠模型空腹血糖的動(dòng)態(tài)變化Table 3 Dynamic changes of fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s，cB／mmol·L－1)

表3 糖尿病小鼠模型空腹血糖的動(dòng)態(tài)變化Table 3 Dynamic changes of fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s，cB／mmol·L－1)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間的正常對(duì)照組比較

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周正常對(duì)照組1.20模型組 24.20±2.24＊＊5.70±1.25 5.60±1.26 5.90±1.27 5.90±1.24 5.60±26.70±1.74＊＊22.20±4.10＊23.00±4.42＊24.40±3.49＊

3 討 論

用ALX建立2型糖尿病小鼠模型，是通過(guò)破壞胰島B細(xì)胞，使細(xì)胞DNA受損，并激活二磷酸腺苷(ADP)核糖體合成酶的活性，使輔酶Ⅰ含量下降，最終導(dǎo)致胰島素缺乏，從而達(dá)到升高血糖的效果，成功建立2型糖尿病模型。這是構(gòu)建糖尿病小鼠模型較常用的方法。關(guān)于A(yíng)LX給藥量、動(dòng)物的體重和性別、光照等因素對(duì)造模效果的影響，相關(guān)文獻(xiàn)較多[6，7]，但對(duì)禁食時(shí)間、是否禁食、有無(wú)墊料等因素對(duì)造模的影響未見(jiàn)報(bào)道。糖尿病的臨床癥狀主要為“三多一少”，即多飲、多食、多尿、體重減輕。目前，對(duì)糖尿病小鼠模型主要采取在塑料籠具里墊木材刨花飼養(yǎng)的方法。由于小鼠尿多且尿中糖含量很高，禁食期間小鼠會(huì)啃食墊料及墊料里的碎飼料和尿液，并且小鼠對(duì)糖的代謝存在個(gè)體差異，因此有墊料的籠具中飼養(yǎng)的小鼠模型FBG值不穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，是否有墊料對(duì)模型小鼠的FBG有顯著性影響，把小鼠放在無(wú)墊料的水沖式籠具里禁食飼養(yǎng)，之后測(cè)量的FBG值相對(duì)比較穩(wěn)定。由于小鼠天性晝伏夜動(dòng)，其進(jìn)食、飲水、戲耍多發(fā)生在夜間，因此本研究采取在晚上22：00開(kāi)始禁食。當(dāng)小鼠的腸道完全排空后，血糖濃度達(dá)到低值，并且比較穩(wěn)定。

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