費(fèi) 辛，蔡宇波，曹蘭芳，李祎群

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院兒科，上海200127；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中醫(yī)科，上海200127)

[本文編輯] 陽凌燕

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是最常見的以氣道高反應(yīng)性為特征的慢性呼吸道疾病，為世界醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的四大頑癥之一。近年來，由于環(huán)境的不斷變化，哮喘發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有3億哮喘病人，我國哮喘病人約達(dá)2 000萬[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，哮喘多歸屬于“哮病”，眾多醫(yī)學(xué)家認(rèn)為宿痰伏于肺是發(fā)病關(guān)鍵。喘可治注射液是國家二類新藥，主要由巴戟天和淫羊藿提取物組成。巴戟天含有單糖、多糖、樹脂、維生素C、必需氨基酸、金屬元素等，淫羊藿含有淫羊藿多糖、淫羊藿苷、淫羊藿黃酮等多種有效成分，二者均具有溫陽補(bǔ)腎、助陽益精和祛風(fēng)除濕等功效。近年來，臨床許多研究發(fā)現(xiàn)，喘可治注射液除具有止咳、平喘的功效外，還具有抗過敏、抗炎、增強(qiáng)應(yīng)激能力、調(diào)節(jié)免疫功能等療效，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究探索喘可治注射液對大鼠抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能的可能機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)該注射液有效治療哮喘的部分作用原理。

1 材料和試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠[上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2008－0016]60只，體重為(250±20)g。

1.2 試藥 喘可治注射液(2ml／支，由巴戟天、淫羊藿等中藥提取物組成，珠海健心醫(yī)藥有限公司，批號(hào)20100102)；地塞米松注射液(5mg／支，上海信誼制藥廠，批號(hào)1004032)。卵蛋白(美國Sigma公司)；大鼠外周血IL－4和INF－γ試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；抗大鼠CD3－PE單抗、抗大鼠CD4－APC單 抗 和 抗 大 鼠 CD25－PerCP 單 抗 (美 國eBioscience公司)；抗大鼠 CD161a－Fitc單抗(美國BD公司)。

1.3 儀器 Par Imaster霧化吸入器(德國百瑞有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。A組為正常對照組；B組為模型組，致敏造模；C、D、E組為喘可治注射液高、中、低劑量組，致敏造模后分別腹腔注射10、5、2.5ml·kg－1·d－1喘可治注射液治療；F組為地塞米松陽性對照組，致敏造模后肌內(nèi)注射地塞米松0.5ml·kg－1·d－1。

2.2 致敏和造模 采用卵蛋白攻擊法致敏大鼠，致敏液為10%氫氧化鋁凝膠和5%卵蛋白的混合液，激發(fā)液為2%卵蛋白液。實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，B至F組每只大鼠腹腔內(nèi)注射致敏液0.5ml。再于大鼠皮下分為5點(diǎn)，每點(diǎn)各注射致敏液0.1ml，合計(jì)每只大鼠注射致敏液1.0ml。A組采用同樣的方式和劑量注射生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第15天開始，將B至F各組大鼠置于自制的密閉箱內(nèi)，采用Par Imaster霧化吸入器吸入新鮮配置的2%卵蛋白液，1次／d，每次20min，連續(xù)吸入14d。A組采用同樣的方式和劑量給予生理鹽水霧化吸入。

2.3 藥物治療 喘可治注射液組于實(shí)驗(yàn)開始的第22天起，霧化吸入致敏液后按照2.1項(xiàng)下劑量分別腹腔注射喘可治注射液，1次／d，連續(xù)給藥7d。地塞米松組在實(shí)驗(yàn)的第26天起，霧化吸入致敏液后馬上肌內(nèi)注射地塞米松注射液0.5ml·kg－1·d－1，連續(xù)3d。

2.4 取材和處理 于實(shí)驗(yàn)的第29天處死各組大鼠，取血樣和肺葉。肺葉用HE染色并行病理切片，觀察炎癥情況。用ELISA法測定大鼠外周血中IL－4和IFN－γ濃度，采用流式細(xì)胞儀測定大鼠外周血中CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD3－CD161a＋NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS6.02軟件進(jìn)行分析，全部數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況觀察 正常對照組大鼠表現(xiàn)為呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏，毛色光潔，飲食、排便無異常。其余各組大鼠經(jīng)卵蛋白激發(fā)后，在霧化激發(fā)過程中均可出現(xiàn)煩躁不安、呼吸增快、腹肌收縮、行動(dòng)遲滯或俯伏不動(dòng)、反應(yīng)遲鈍等癥狀。當(dāng)進(jìn)入用藥治療階段后，喘可治注射液各劑量組和地塞米松組大鼠的上述癥狀均得到不同程度的改善。

3.2 肺部炎癥反應(yīng) 如圖1所示，3個(gè)劑量的喘可治注射液組的大鼠雖然與正常對照組大鼠相比，尚存在炎癥的各種表現(xiàn)，但與模型組大鼠比較，在病理方面均表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)減輕，炎性細(xì)胞侵潤少，血管平滑肌增生程度亦輕。而與陽性對照地塞米松組相比，喘可治注射液組大鼠總體炎癥反應(yīng)情況接近。

3.3 IL－4和INF－γ濃度測定 從表1結(jié)果可見，與模型組相比，高、中、低劑量喘可治注射液組和地塞米松組的IL－4濃度均明顯下降(P＜0.01)，各喘可治注射液組間及與地塞米松組比較，IL－4濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中高劑量喘可治注射液組的IL－4濃度絕對值相對其他組降低更多。喘可治注射液組IFN－γ的濃度均較模型組有所上升，但僅高劑量組有顯著差異(P＜0.01)。各劑量喘可治注射液組IFN－γ濃度與地塞米松組比較均無顯著差異。

圖1 各組大鼠肺部組織病理切片(HE染色，×100)Figure 1 Pathological sections of lung tissues of each group in rats(HE staining，×100)

表1 大鼠外周血中IL－4和INF－γ濃度比較Tabel 1 Comparison of concentrations of IL－4and IFN－γof peripheral blood in rats(n＝10，±s，ρB／pg·ml－1)

表1 大鼠外周血中IL－4和INF－γ濃度比較Tabel 1 Comparison of concentrations of IL－4and IFN－γof peripheral blood in rats(n＝10，±s，ρB／pg·ml－1)

＊＊P＜0.01，與模型組比較

組別 IL－4 IFN－γ正常組 7.87±3.85＊＊40.85±16.04模型組 50.94±20.11 24.57±7.59喘可治注射液高劑量組 10.65±4.13＊＊ 62.34±26.36＊＊喘可治注射液中劑量組 17.50±6.97＊＊ 34.32±9.53喘可治注射液低劑量組 20.68±6.35＊＊ 28.16±13.03地塞米松組 17.17±8.26＊＊26.60±11.67

3.4 CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD3－CD161a＋NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比 高、中、低劑量喘可治注射液組大鼠外周血CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比明顯上調(diào)，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。各治療組與地塞米松組比較，CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞百分比無顯著性差異(P＞0.05)。CD3－CD161a＋NK 細(xì)胞的百分比模型組最低，地塞米松組最高，高、中、低劑量喘可治注射液組百分比也有升高，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間比較無顯著差異(P＞0.05，見表2)。

4 討 論

支氣管哮喘目前多采用包括糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的抗炎藥物治療，但長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用使其在應(yīng)用上受到限制。喘可治注射液主要由巴戟天、淫羊藿等中藥材經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)手段提取精制而成，以淫羊藿為君藥，輔以巴戟天。淫羊藿和巴戟天均始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)腎助陽、祛風(fēng)除濕的功效。從中醫(yī)理論角度說，喘可治注射液的治療機(jī)制是溫陽補(bǔ)腎、平喘止咳、標(biāo)本同治、虛實(shí)兼顧。中醫(yī)的“腎”與“陽”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫功能密切相關(guān)，有研究者認(rèn)為溫陽補(bǔ)腎藥能夠通過調(diào)節(jié)下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)和免疫網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，且研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎藥物是先作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，而后才影響免疫系統(tǒng)。

表2 大鼠外周血中CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD3－CD161a＋NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比Table 2 Percentages of CD4＋CD25＋T cells and CD3－CD161a＋ NK cells to lymphocytes of peripheral blood in rats(n＝10，±s，%)

表2 大鼠外周血中CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD3－CD161a＋NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比Table 2 Percentages of CD4＋CD25＋T cells and CD3－CD161a＋ NK cells to lymphocytes of peripheral blood in rats(n＝10，±s，%)

＊P＜0.05，與模型組比較

細(xì)胞正常組組別 CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞CD3－CD161a＋NK 2.05±0.56 10.77±4.02模型組 2.39±0.68 7.84±2.83喘可治注射液高劑量組 2.67±0.76＊ 8.84±2.10喘可治注射液中劑量組 2.87±0.77＊ 9.78±2.18喘可治注射液低劑量組 3.42±0.91＊ 7.96±2.66地塞米松組2.11±0.98 12.24±5.79

IL－4和IFN－γ分別為IgE的正負(fù)調(diào)節(jié)因子，兩者比例的失衡，是哮喘病人體內(nèi)IgE合成過多的主要原因[2]。有研究提出，通過增加IFN－γ的濃度，降低IL－4水平來調(diào)節(jié)1型輔助性T細(xì)胞(Th1)／Th2之間的平衡是治療哮喘的一個(gè)新途徑[3]。

CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞能有效地調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞，參與自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展，既能抑制Th1細(xì)胞，也能抑制Th2細(xì)胞，是控制免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。有研究結(jié)果提示CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的不足和(或)功能降低，可能在哮喘中起著十分重要的作用。有研究表明，NK細(xì)胞也是哮喘發(fā)病機(jī)制中重要的效應(yīng)細(xì)胞之一。NK細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的微環(huán)境下功能不同。在IL－4的作用下，人類和鼠的NK細(xì)胞分泌IL－5和IL－13，兩者均對嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟有不可替代的作用。而IL－12和IFN－γ會(huì)抑制 NK細(xì)胞分泌IL－5和IL－13，在IL－12作用下，NK細(xì)胞分泌IFN－γ，并消滅樹突狀細(xì)胞，從而使免疫反應(yīng)向 Th1方向分化[4，5]。因此，NK細(xì)胞在過敏性疾病，如哮喘中也許具有調(diào)節(jié)Th1／Th2型免疫反應(yīng)的能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，去除NK細(xì)胞后，哮喘模型小鼠的氣道炎癥的發(fā)作受到抑制，肺中的嗜酸性粒細(xì)胞和血清中的IgE含量明顯降低[6]。目前認(rèn)為，在哮喘疾病中，NK細(xì)胞功能的異常導(dǎo)致和加重了氣道炎癥，如能在炎癥發(fā)生和發(fā)展的過程中使NK細(xì)胞得到正確的細(xì)胞因子刺激，使其分泌IFN－γ，則氣道炎癥可以減輕。

本研究發(fā)現(xiàn)，喘可治注射液作為一種溫陽補(bǔ)腎的中藥合劑，能夠減輕哮喘大鼠肺部組織的炎性反應(yīng)，起到一定的消炎作用。其通過影響IL－4、IFN－γ、CD4＋CD25＋T調(diào)節(jié)細(xì)胞含量，在一定程度上糾正Th1／Th2失衡，從而改善哮喘模型大鼠的病情，且其在幾個(gè)方面產(chǎn)生的作用與地塞米松的效果比較接近。在對CD3－CD161a＋NK細(xì)胞的影響方面，本研究發(fā)現(xiàn)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]在數(shù)量沒有顯著差異性變化的情況下，是否各治療方案實(shí)際是對血NK細(xì)胞的活性產(chǎn)生了影響，從而產(chǎn)生緩解哮喘的作用，該推測有待進(jìn)一步研究。

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