丁肇衛(wèi)，湯 華，張 文＊

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)外國(guó)語學(xué)院英語系，濟(jì)南250355；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物研究中心，上海200433)

[本文編輯] 姚春芳

海洋中蘊(yùn)藏著豐富的生物資源，也包括許多人類至今尚未觸及的未知領(lǐng)域。由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性(高壓、高鹽、缺氧、避光)，使得各種海洋生物物種之間的生存競(jìng)爭(zhēng)非常激烈，迫使很多海洋生物產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)特殊、生物活性顯著的次生代謝物質(zhì)，以便在嚴(yán)酷的生態(tài)環(huán)境下繁衍生存。這些次生代謝產(chǎn)物成為藥源性活性物質(zhì)的重要源泉。

現(xiàn)代海洋藥物的研究可以追溯到20世紀(jì)50年代初期海綿核苷及海綿尿苷的發(fā)現(xiàn)[1]，這直接導(dǎo)致了現(xiàn)在臨床上仍然在使用的阿糖胞苷和阿糖腺苷的上市。20世紀(jì)60年代末，隨著“向海洋要藥”口號(hào)的提出以及前列腺素從柳珊瑚中的發(fā)現(xiàn)[2]，海洋作為藥源活性物質(zhì)的巨大潛力已得到廣泛認(rèn)知，從而掀起了第一次海洋天然產(chǎn)物化學(xué)研究的高潮。但由于海洋天然產(chǎn)物分子骨架往往新穎奇特、十分復(fù)雜，而且化合物在生物中的含量很低，從而給結(jié)構(gòu)解析與確定帶來了相當(dāng)大的困難，所以研究進(jìn)展一度相當(dāng)緩慢。到了20世紀(jì)80年代，現(xiàn)代波譜學(xué)、現(xiàn)代色譜學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，使海洋天然產(chǎn)物研究的高效、精細(xì)、目標(biāo)化和生態(tài)化成為可能。由此，以生物活性為先導(dǎo)的對(duì)于海洋生物化學(xué)成分的研究揭開了新的篇章。

ET－743(圖1)是從加勒比海鞘(圖2)中分離得到的一種四氫異喹啉生物堿類化合物Ecteinascidin 743的簡(jiǎn)寫。最初由西班牙Pharm Mar公司研發(fā)，后授權(quán)給美國(guó)強(qiáng)生及旗下強(qiáng)生制藥研發(fā)公司。2007年7月已被歐盟人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)(CHMP)批準(zhǔn)上市銷售，用于治療難控制的軟組織肉瘤，商品名Yondelis(Trabectedin)。ET－743從發(fā)現(xiàn)、研究到上市，歷經(jīng)了現(xiàn)代海洋藥物發(fā)展的全過程，生動(dòng)體現(xiàn)了現(xiàn)代科技發(fā)展對(duì)于生產(chǎn)力的巨大推動(dòng)作用，成為現(xiàn)代海洋藥物研究的成功典范。

1 ET－743的發(fā)現(xiàn)

圖1 ET－743的分子結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic molecular structure of ET－743

圖2 加勒比海鞘Figure 2 Caribbean tunicate Ecteinascidia turbinate

早在1969年美國(guó)國(guó)家癌癥研究會(huì)在對(duì)抗癌活性物質(zhì)進(jìn)行廣泛篩選的過程中，發(fā)現(xiàn)海鞘的提取物顯示較強(qiáng)的抗癌活性[3]。其后不斷有人對(duì)此進(jìn)行研究，但由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平無法滿足對(duì)活性物質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定要求，最終均一無所獲。直到1986年，伊利諾伊斯大學(xué)的Rinehart小組從海鞘分離得到6個(gè)具有顯著細(xì)胞毒活性的單體成分ET－729、ET－743、ET－745、ET－759A、ET－759B 和 ET－770[ET后的數(shù)字代表當(dāng)時(shí)經(jīng)快速原子轟擊質(zhì)譜測(cè)定法(FABMS)測(cè)得的各化合物的分子量]。其中，ET－743得率最高(約為0.000 1%)，其體外對(duì)小鼠白血病腫瘤細(xì)胞株L1210的IC50值可達(dá)0.5ng／ml，體內(nèi)對(duì)P388白血病小鼠的有效作用濃度可達(dá)15μg／kg，顯示出良好的抗腫瘤活性。1990年，隨著現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)的發(fā)展，借助于新的技術(shù)，特別是二維核磁共振技術(shù)的幫助，Wright及Rinehart兩個(gè)小組同時(shí)確定了ET－743的分子是一類具有四氫異喹啉骨架的生物堿結(jié)構(gòu)，ET－729、ET－745、ET－759A、ET－759B和ET－770五個(gè)結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)構(gòu)也一并得到確定[4，5]。ET－743的結(jié)構(gòu)隨后得到了單晶X－衍射的確認(rèn)[6]。

2 ET－743的藥理學(xué)研究

研究表明，ET－743具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。體外活性測(cè)試表明，ET－743對(duì)包括白血病、黑素瘤、宮頸癌、肺癌、乳腺癌、軟組織肉瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、直腸癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌及前列腺癌等腫瘤細(xì)胞都顯示了良好的抑制活性[7，8]。其藥理活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，如紫杉醇、喜樹堿、多柔比星(阿霉素)、絲裂霉素、順鉑、博來霉素及依托泊苷等。ET－743與多柔比星等抗腫瘤藥物顯示協(xié)同作用。ET－743與多柔比星、三甲曲沙及紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)纖維肉瘤(HT－1080)和脂肪肉瘤(HS－18)細(xì)胞的活性比ET－743單獨(dú)用藥活性顯著增強(qiáng)[9]。體內(nèi)研究表明，腹腔及靜脈給藥時(shí)，ET－743可顯著提高多種腫瘤裸鼠模型的生存率，包括白血病、黑素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等，療效具有良好的劑量相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)藥物致死現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)表明，間歇治療效果明顯優(yōu)于分別連續(xù)給藥治療，ET－743對(duì)接種順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞的裸鼠也顯示有效[10]。

對(duì)于軟組織肉瘤，ET－743的活性作用在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中就顯現(xiàn)出來[11]。在ET－743正式用于該組織疾病的試驗(yàn)之前，一項(xiàng)來自Ⅰ期試驗(yàn)和酌情使用ET－743的匯總分析，報(bào)告25例軟組織肉瘤病人中有14例在使用ET－743之后，病情得到了控制[12]。在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，ET－743被用于治療卵巢癌、直腸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤和間皮瘤等多種類型的癌癥，而治療效果最顯著的是軟組織肉瘤、乳腺癌和卵巢癌[13，14]。在3項(xiàng)包括189名先前接受過治療的軟組織肉瘤病人的Ⅱ期臨床研究數(shù)據(jù)表明，ET－743能使50%的病人產(chǎn)生抗癌應(yīng)答，使其病情穩(wěn)定，中位生存期為10.3個(gè)月，19.8%的病人無進(jìn)展生存中位數(shù)為6個(gè)月，29.3%的病人生存期在2年以上。ET－743對(duì)其他化療藥物，如多柔比星和異環(huán)磷酰胺無效的病人也有效。ET－743能被病人很好地耐受，劑量限制毒性(dose－limiting toxicity，DLT)不累積、可逆和可控，不同于其他細(xì)胞毒藥物的是其沒有心臟和神經(jīng)毒性，禿頭癥也很少[15]。其他最新臨床數(shù)據(jù)也證實(shí)，ET－743治療軟組織肉瘤療效顯著，能提高病人的生存率[16，17]。在Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)中，ET－743被用于治療軟組織肉瘤和卵巢癌[18]。歐盟和美國(guó)FDA已先后認(rèn)同ET－743(商品名Yondelis)是治療軟組織肉瘤和卵巢癌的罕見藥物。

ET－743的抗腫瘤活性涉及多重作用機(jī)制，主要是通過在DNA的復(fù)制過程中使DNA雙螺旋小溝處鳥嘌呤的N－2烷基化，從而阻斷DNA的復(fù)制和合成，抑制腫瘤細(xì)胞分裂生長(zhǎng)[19，20]。另外，ET－743的抗腫瘤作用機(jī)制還涉及抑制遺傳修復(fù)途徑[21，22]、干擾細(xì)胞周期而導(dǎo)致p53依賴性的細(xì)胞程序化死亡[23，24]、擾亂腫 瘤 細(xì) 胞 微 管 網(wǎng) 絡(luò)[25]、在 DNA 和 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ之間引起交聯(lián)[26－28]等。對(duì) ET－743藥理活性及作用機(jī)制深入系統(tǒng)的研究，表明ET－743是一個(gè)良好的新藥先導(dǎo)化合物，為其成藥性研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 ET－743的化學(xué)研究

ET－743復(fù)雜的特異性結(jié)構(gòu)及良好的抗腫瘤活性引起了化學(xué)界及藥理學(xué)界的廣泛關(guān)注，激發(fā)了人們對(duì)相關(guān)類似化合物研究的極大興趣。一方面，以Rinehart為首的課題組繼續(xù)從天然來源中獲取ET－743的類似物，并對(duì)這些類似物的生物活性進(jìn)行廣泛的抗腫瘤系統(tǒng)研究，企圖尋找得到活性更好的有機(jī)分子。經(jīng)過不懈的努力，他們先后得到了ET－722、ET－736、ET－734－N12氧 化 物[6]、ET－594、ET－597、ET－583、ET－596[7]等一系列結(jié)構(gòu)類似物，但其腫瘤細(xì)胞毒活性仍然以ET－743為最好。

由于ET－743在海鞘中的含量極低，僅達(dá)生物體重的百萬分之一，所以其化學(xué)合成研究就顯得十分重要和迫切。為了解決藥效實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)藥物的需求問題，合成化學(xué)家對(duì)ET－743的合成工作進(jìn)行了大量的努力和探索，先后有4個(gè)課題組完成了對(duì)ET－743的全合成工作。1996年，Corey課題組首次報(bào)道了對(duì)ET－743的全合成工作[29]，主體反應(yīng)是在巧妙地運(yùn)用Strecker反應(yīng)和分子內(nèi)Mannich反應(yīng)兩個(gè)經(jīng)典化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過40多步反應(yīng)完成的，總收率0.53%。該反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)在于通過分子內(nèi)Mannich環(huán)合反應(yīng)，一步反應(yīng)同時(shí)構(gòu)建C、D兩環(huán)，形成五環(huán)結(jié)構(gòu)，但由于兩個(gè)前體化合物的合成非常繁瑣，限制了該方法的應(yīng)用。2002年，Endo等[30]報(bào)道了ET－743立體專一性全不對(duì)稱合成研究，整個(gè)路線也經(jīng)歷了40多步反應(yīng)，總收率達(dá)到0.78%。他們通過四組分Ugi縮合反應(yīng)、分子內(nèi)Heck反應(yīng)及隨后酚－醛環(huán)化得到五環(huán)結(jié)構(gòu)。該路線是按照CD－B依次完成對(duì)環(huán)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建工作[30]。第3個(gè)全合成的研究報(bào)道完成于2006年，構(gòu)環(huán)順序?yàn)镈－CB，反應(yīng)過程大大縮短，只有31步，總收率也進(jìn)一步顯著提高，達(dá)到了1.7%[31]。同年報(bào)道的另一個(gè)全合成反應(yīng)的構(gòu)環(huán)次序?yàn)锽－C－D，C、D的成環(huán)反應(yīng)主要是通過分子內(nèi)Pictet－Spengler反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，但該步反應(yīng)收率較低，僅42%～58%[32]。另外，還有一些未完成的全合成研究[33－36]，這些研究在五元環(huán)骨架的構(gòu)成、芳環(huán)及其他功能基團(tuán)的修飾方面都進(jìn)行了有益的探索。但總體而言，化學(xué)合成反應(yīng)的步驟較為繁瑣，反應(yīng)要求的條件無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求，因而，現(xiàn)階段的化學(xué)全合成方法很難解決原料藥的供應(yīng)問題。

人們轉(zhuǎn)而試圖通過水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法富集實(shí)驗(yàn)所需的ET－743，并在歐洲進(jìn)行了對(duì)海鞘的大規(guī)模養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。通過養(yǎng)殖可以獲得大量的海鞘，但其中的ET－743含量變化很大，很難獲得穩(wěn)定的藥物來源。最后，負(fù)責(zé)藥物研發(fā)授權(quán)的Pharma Mar公司在這方面取得了突破，他們以cyanosafracin B(圖3)為起始原料，利用該分子與ET－743具有相似的五環(huán)骨架和手性中心，進(jìn)行半合成研究。通過對(duì)分子中相應(yīng)部位的取代基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，最終得到ET－743，總收率1.0%[37]。由于cyanosafracin B 可以通過發(fā)酵的方法由熒光假單胞菌大量獲得，從而能夠獲得足夠量的藥源供應(yīng)。通過同樣的方法，他們還對(duì)ET家族其他化合物進(jìn)行了半合成研究，仍以cyanosafracin B為起始原料，通過對(duì)不同官能團(tuán)的保護(hù)、去保護(hù)及其他修飾，最終得到不同的目標(biāo)化合物，包 括 ET－729、ET－745、ET－759B、ET－736、ET－637，及 ET－594[38]。

圖3 Cyanosafracin B的分子結(jié)構(gòu)示意圖Figure 3 Schematic molecular structure of cyanosafracin B

由于具有了充足的藥物來源，ET－743相關(guān)的藥效學(xué)研究、體內(nèi)代謝研究及藥物安全性評(píng)價(jià)等一系列成藥性研究得以順利開展，并于2001年5月由歐洲藥品評(píng)估機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)ET－743作為治療軟組織肉瘤的孤藥進(jìn)入臨床研究，2003年10月又批準(zhǔn)其作為治療卵巢癌的孤藥，并最終于2007獲準(zhǔn)上市。

作為第一個(gè)海洋抗腫瘤藥物，ET－743在其發(fā)現(xiàn)近40年、結(jié)構(gòu)確定17年之后得以上市，是海洋藥物研究的重要事件，是多領(lǐng)域、多學(xué)科科研工作者共同努力的結(jié)果。在藥物發(fā)現(xiàn)的最初10多年時(shí)間里，很多科學(xué)家參與到活性分子分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定工作中，但均一無所獲，是色譜和波譜技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步最終導(dǎo)致了ET－743結(jié)構(gòu)的成功鑒定，期間耗費(fèi)了21年的時(shí)間，這也是海洋藥物研究由低潮再次走向高潮的一段特定歷史時(shí)期。

海洋藥物研究中另一個(gè)不可忽視的問題就是藥源問題。與陸生天然產(chǎn)物不同，海洋天然產(chǎn)物往往具有更高的活性和更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其含量也更低，這不但給結(jié)構(gòu)鑒定帶來了挑戰(zhàn)，同時(shí)經(jīng)常造成活性測(cè)試所需藥量的嚴(yán)重不足。海洋標(biāo)本采集的隨機(jī)性和不確定性，使這一矛盾顯得尤為突出。因此，海洋天然產(chǎn)物的藥源解決更多地依賴于化學(xué)技術(shù)及現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)，如基因工程、組織培養(yǎng)等。由于海洋分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，化學(xué)合成往往需要經(jīng)過較長(zhǎng)的路線和特殊的反應(yīng)條件和試劑，這給工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大障礙。因此，海洋藥物的研究盡管方興未艾，但中間的困難和研究瓶頸值得引起大家的足夠關(guān)注和重視。

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