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泥蚶血淋巴抗菌活性分析

王雪鵬 張 鑫 張 玲 （山東農業(yè)大學動物科技學院 泰安 271018）繆宇平*（農業(yè)部海洋與河口漁業(yè)重點開放實驗室中國水產科學研究院東海水產研究所 上海）

以泥蚶為試驗材料，分別用活的和滅活的副溶血弧菌通過浸泡方式誘導其產生抗菌物質，并以副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌為指示菌進行抗菌活性測定。結果表明：(1)活的和滅活的副溶血弧菌誘導條件對泥蚶血淋巴的抗菌活性影響不顯著(P>0.05)，但比對照組差異顯著(P<0.05)；(2)血淋巴對副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有抑菌作用，尤其是副溶血弧菌和白色念珠菌。

泥蚶 血淋巴 抗菌活性

泥蚶，隸屬于軟體動物門、瓣鰓綱、列齒目、蚶科、泥蚶屬，是一種棲息于沿海灘涂的廣溫性雙殼貝類，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中國、韓國、泰國、菲律賓以及馬來西亞等國家，在我國分布于山東半島以南沿海，是山東、浙江、福建和廣東等省重要的養(yǎng)殖經濟貝類(王日昕等, 2005)。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，泥蚶細菌病也頻繁暴發(fā)，對泥蚶養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重危害。近幾十年來，很多報道證明抗生素是治療細菌病的一種重要手段，然而又會引起水產品抗生素殘留、細菌耐藥性等問題。為了更好預防和控制細菌感染，必須發(fā)展一種生物方法(例如抗菌肽)來控制。

抗菌肽，也稱為肽類抗生素，是一類小分子短肽，具有抗菌力強、抗菌譜廣、活性穩(wěn)定、可以中和細菌內毒素、很難產生耐藥性等特點。抗菌肽是Boman等人在1981年首次從惜古比天蠶中發(fā)現的，命名為天蠶素。之后國內外許多研究者相繼在其他生物如昆蟲(Rees et al，1997)、哺乳動物(王莉莉等, 2004)、兩棲動物(Lai et al，2002b)、植物(Asiegbu et al，2003)以及微生物(劉潁等, 1999)中均發(fā)現抗菌物質，表明抗菌肽廣泛存在于細菌、植物、脊椎和無脊椎動物中，是先天免疫系統中的重要因子。至今報道的抗菌肽已經超過500種(洪旭光等, 2004)。

近10年對抗菌肽的研究已深入到分子結構、作用機制、基因的表達與調控等方面，但對貝類抗菌肽的研究卻非常少，目前，泥蚶(Jianmin Zhao et al，2007)、貽貝(仲燕等, 2005)、牡蠣(M. Gonzalez et al，2007)等養(yǎng)殖貝類的某個抗菌肽及其生物學活性進行初步研究。本研究主要探討活的和滅活的副溶血弧菌對泥蚶血淋巴抗菌物質的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與菌株

試驗動物：成年泥蚶，采自浙江溫州海域，以潔凈海水在通氧條件下養(yǎng)于恒溫(18~20℃)水族箱。試驗菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、和副溶血弧菌由浙江省海洋水產養(yǎng)殖研究所閆茂倉惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 副溶血弧菌誘導物的制備 試驗菌株接種于ZoBell 2116E瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)24h，生理鹽水洗下菌苔，2000r/min離心10min，去上清液，沉淀再用生理鹽水洗3次，配成濃度為3×1011CFU/ml的菌懸液，0.1MPa滅菌20min或不滅菌，分別用于滅活菌和活菌免疫誘導。

1.2.2 試驗設計及分組 成年泥蚶3000只，隨機分成3組，A組用濃度為3×108CFU/ml滅活的副溶血弧菌處理，B組用濃度為3×108CFU/ml活的副溶血弧菌處理，C組不處理。

1.2.3 血淋巴的采集 分別在誘導處理后的第1、2、4、8、16和24h，用無菌注射器從供試貝類體內采集血淋巴，每組采集150只，血樣混合后，5 000r/min低溫(4℃)離心10min，取上清液，經0.22μm孔徑無菌過濾器過濾備用。按同樣方法從未經誘導處理的貝類體內采集血淋巴作為對照血淋巴。

1.2.4 抗菌活性測定 每毫升含106細菌的菌液100μl均勻涂布于固體細菌培養(yǎng)基表面，將經過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加一定量的泥蚶血淋巴，于30℃培養(yǎng)10~20h，觀察抑菌圈形成與否，并測定抑菌圈直徑。

2 結果

血淋巴對副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌結果見表1。從表1得知，泥蚶在誘導前其血淋巴中含有對抑菌活性物質，經過誘導后對這兩種菌的抑菌活性有明顯的提高，誘導后16~24h后對指示菌的抑菌活性最強，其后一直保持較高的抑菌活性?；罹恼T導效果比滅活菌的誘導效果略好。

表1 誘導前后泥蚶血淋巴的抑菌活性比較 (mm)

3 討論

魏玉西等報道，在軟體動物中，缺乏抗體介導的免疫反應，因而它不能通過接種抗原來達到產生免疫抗體的自我保護的目的。但是，可以通過提高貝類的非特異免疫防御系統來增強貝類的抗病力。本試驗中，通過誘導可使泥蚶血淋巴的抑菌活性增強，說明泥蚶的非特異性免疫因子存在一定程度的可誘導性。因此，在實際生產中，可通過適當的方法誘導泥蚶產生更強的抗病力。

目前，研究者發(fā)現貝類的抗菌物質主要有防御素、貽貝素、貽貝肽、貽貝霉素等多種抗菌物質，分別對革蘭氏陽性、陰性菌、真菌等有抗菌效果。但與其它生物(如昆蟲、哺乳動物、兩棲動物、植物以及微生物)抗菌肽的研究相比，在種類和研究深度上還有很大差距。

[1] Asiegbu FO, Choi W, Li GS, Nahalkova J, Dean RA. 2003. Isolation of a novel antimicrobial peptide gene (Sp-AMP) homologue from Pinus sylvestris (Scots pine) following infection with the root rot fungus Heterobasidion annosum [J]. FEMS Microbiology Letters, 228 : 27- 31.

[2] Boman HG, Steiner H. 1981. Humoral immunity in Cecropia pupae [J]. Curr. Top. Microbial . Immunol , 94 : 75 - 91.

[3] Jianmin Zhao, Linsheng Songa, Chenghua Li, Duojiao Ni, Longtao Wu, Ling Zhu, Hao Wang, Wei Xu. Molecular cloning, expression of a big defensin gene from bay scallop Argopecten irradians and the antimicrobial activity of its recombinant protein. Molecular Immunology 44 (2007) 360–368.

[4] Lai R , Liu H , Lee WH , Zhang Y. 2002b. Identification and cloning of a trypsin inhibitor from skin secretions of Chinese red-belly toad Bombina maxima [J] . Comparative Biochemistry and Physiology Part B , 131 : 37 - 53.

[5] M. Gonzalez, Y. Gueguen, G. Desserre, J. de Lorgeril, B. Romestand, E. Bache`re . Molecular characterization of two isoforms of defensin from hemocytes of the oyster Crassostrea gigas. Developmental and Comparative Immunology 31 (2007) 332–339.

[6] Rees JA , Moniatte M , Bulet P. 1997. Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee , Bombus pascuorum (Hymenoptera , Apoidea) [J ] . Insect Biochen . Molec . Biol . , 27 (5) : 413 -422.

[7] 洪旭光, 孫修勤, 張進興等. 海洋抗菌肽研究進展[J]. 高技術通訊, 2004.2 :105 - 110.

[8] 劉潁, 徐慶, 陳章良.抗真菌肽LP21的分離純化及特征分析[J]. 微生物學報, 1999. 39(5): 441-447.

[9] 王莉莉, 潘小玲, 黃寧等.人子宮內膜粘液抗菌多肽的分離純化[J]. 四川生理科學雜志, 2004. 26(1): 5-6.

[10] 王日昕, 李太武, 呂振明等,泥蚶(Tegillarca granosa)不同地理居群同工酶變異及遺傳分化的研究[J]. 海洋與湖沼, 2005. 36(3): 227-234.

[11] 魏玉西, 郭道森, 李麗等.幾種海產雙殼貝類血淋巴中抗菌物質的誘導及其活性測定[J]. 海洋科學, 2002. 26(8): 5-8.

[12] 仲燕, 劉軍華, 張建鵬等. 東海貽貝抗菌肽Myticin A 基因的克隆表達及其生物學活性[J]. 第二軍醫(yī)大學學報. 2005, 26(1): 65-68.

本課題由農業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點開放實驗室開放基金資助(開-09-12)

（2011–11–19）

Q959.215

A

1007-1733(2011)12-0001-02