張?zhí)煊? 支春翔 張浩 陳慧娟 單書林 莫海珍

摘要：通過對(duì)茶葉進(jìn)行單一菌種和混合菌種的人工接種發(fā)酵，采用微波輔助浸提茶多酚，來研究茶葉發(fā)酵過程中多酚的變化規(guī)律及不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性。結(jié)果表明，茶葉在發(fā)酵過程中多酚的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而降低，其中接種黑曲霉、酵母菌及接種黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉的茶葉中多酚含量變化趨勢(shì)明顯，分別從３１．１６％降到５．３２％，３１．１６％降到７．３５％；不同菌種發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力存在差別，提取物的抗氧化能力隨時(shí)間延長呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：茶葉發(fā)酵；菌種；多酚；抗氧化

中圖分類號(hào)：Ｓ５７１．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）15－3144-04

Ｓｔｕｄy ｏｎ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｉｎ Ｔｅａ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ

ＺＨＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｙｉｎｇ１，２，ＺＨＩ Ｃｈｕｎ－ｘｉａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｈａｏ１，ＣＨＥＮ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ１，ＳＨＡＮ Ｓｈｕ－ｌｉｎ１，ＭＯ Ｈａｉ－ｚｈｅｎ１

（１． Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｅｎａｎ Ｓｈａｎｇｓｈｕｉ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｂｕｒｅａｕ，Shangshui ４６６１００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｅａ ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ ｓｔrａｉｎｓ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ， ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｓ were ｓｔｕｄｉｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｅａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ： ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ prolonging ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅａ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ， ｙｅａｓｔ， ｒｏｏｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖａｒｉｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ． Ｔｈｅｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ３１．１６％ ｔｏ ５．３２％， ｆｒｏｍ ３１．１６％ ｔｏ ７．３５％； ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｉｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ， ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅd ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅd ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｉｍｅ prolonged．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： tea ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｓｔｒａｉｎｓ； ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ

普洱茶具有一定的保健作用，其抗氧化作用被認(rèn)為是其保健功能最重要的機(jī)理。目前國內(nèi)外有關(guān)綠茶和紅茶的抗氧化作用及機(jī)理研究報(bào)道很多，而關(guān)于普洱茶的報(bào)道還非常有限，對(duì)普洱茶發(fā)酵過程中抗氧化活性的報(bào)道更少［１－３］。茶多酚又稱茶鞣或茶單寧，是茶葉中的一種主要活性成分，有著獨(dú)特的抗氧化效果［４］。茶葉中多酚類很多，包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為茶多酚，是形成茶葉色香味的主要成分之一，是影響茶葉品質(zhì)好壞的重要標(biāo)志［５］，也是茶葉中有保健功能的主要成分之一。在茶葉發(fā)酵過程中，微生物直接影響普洱茶風(fēng)味的形成，有關(guān)研究報(bào)道顯示，天然發(fā)酵的普洱茶中的菌種有黑曲霉、根曲霉、青霉和酵母菌［６－９］。其中，黑曲霉數(shù)量處于優(yōu)勢(shì)地位，其次是酵母菌。不同的菌種產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，從而對(duì)茶葉的品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響［１０］。

通過人工接種發(fā)酵，不同的微生物在發(fā)酵過程中也會(huì)造成多酚類結(jié)構(gòu)、含量和功能性質(zhì)的變化［１１－１２］。在不同微生物的作用下，通過對(duì)茶多酚的變化規(guī)律以及提取物抗氧化活性的研究，對(duì)進(jìn)一步開展發(fā)酵茶功能性成分的研究和發(fā)酵菌種的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料普洱茶由杭州中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供。

１．１．２試劑無水乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、硫氰酸銨、二苯代苦味?；杂苫ǎ模校校龋┑染鶠榉治黾儯涣姿峋彌_液（ｐＨ ６．６，０．２ ｍｏｌ／Ｌ）。

１．１．３儀器ＳＨＰ型生化培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電冰箱，中國新飛集團(tuán)；無菌操作臺(tái)，上海新藝儀器廠；ＸＯＧＯＺ型高壓滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械廠；１０１型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；ＭＤ１００－２型分析天平，上海天平儀器廠；ＴＤＬ５０Ｂ臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Ｇ８０Ｆ２０Ｎ２Ｌ－ＤＧ（Ｓ０）格蘭仕微波爐，格蘭仕（中山）電器有限公司；ＷＦＪ７２００型可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

１．２方法

１．２．１普洱茶優(yōu)勢(shì)菌的分離與純化稱?。?ｇ普洱熟茶樣品，置于培養(yǎng)皿中，用無菌去離子水沖洗１次，將樣品轉(zhuǎn)移至無菌研缽中研碎。將處理好的樣品在無菌操作室里涂布，將涂布過的平板培養(yǎng)基倒置于２８ ℃條件下暗培養(yǎng)３６ ｈ。用接種環(huán)在各菌落上挑取少量在平板培養(yǎng)基表面“Ｚ”形接種。將接種過的平板培養(yǎng)基倒置于２８ ℃條件下暗培養(yǎng)。根據(jù)初分菌落的形態(tài)特征，用接種針挑取各菌落的少量菌絲體，接種在事先準(zhǔn)備好的ＰＤＡ瓊脂培養(yǎng)基上（每個(gè)平板內(nèi)接種３個(gè)菌落）。通過繼代反復(fù)培養(yǎng)，得到純化的黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉。

１．２．２發(fā)酵試驗(yàn)在分離出的純化菌種中，選取菌種制備菌種液，每個(gè)處理用茶葉１００ ｇ，加水量為茶葉質(zhì)量的３０％，分別用不同的菌種液進(jìn)行接種，菌種液分別為黑曲霉，（黑曲霉、酵母菌），（黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉），自然發(fā)酵４種，分別命名為處理１、處理２、處理３和處理４，在溫度５０℃、濕度為７０％～９０％的條件下培養(yǎng)，每３ ｄ測(cè)１次茶多酚含量［１３，１４］。

制備菌種液時(shí)，總的菌種量是一定的，按一定比例接種菌種，挑選長勢(shì)均勻的培養(yǎng)基，以１ ｃｍ２為單位的菌種量來制備菌種液。本試驗(yàn)采用接種總量為１ ｃｍ２的菌種量來接種。

１．２．３微波法輔助提取茶多酚稱?。?ｇ茶葉，用４０％乙醇浸提，在料液比為１∶９ （Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），微波功率為２８０ Ｗ（中低火檔）的條件下，在微波爐中加熱３０ ｓ，靜置冷卻接近室溫，再加熱３０ ｓ，靜置冷卻至室溫，離心分離得上清液，定容至２５ ｍＬ，備用［１５－１７］。

發(fā)酵過程中，由于茶葉含水量較高，不易研磨，微波浸提前先把茶葉烘干（５０ ℃），易于研磨，然后再１０３ ℃烘干直至恒重，測(cè)茶葉的干物質(zhì)含量。

１．２．４分光光度法測(cè)茶多酚含量測(cè)定方法參照ＧＢ／Ｔ８３１３－２００２茶多酚測(cè)定。具體方法如下：準(zhǔn)確吸取樣液０．０８０ ｍＬ，注入２５ ｍＬ的容量瓶中，加水４ ｍＬ和酒石酸亞鐵溶液５ ｍＬ，充分混合，再加ｐＨ ７．５的磷酸鹽緩沖液至刻度，用１０ ｍｍ比色杯，在波長５４０ ｎｍ處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度（Ａ）。茶多酚含量（以干態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，％）計(jì)算公式如下。

茶多酚含量＝Ａ×１．９７５×２×Ｌ１×１００／１ ０００×Ｌ２×Ｍ０×ｍ

式中，Ｌ１為試液的總量，ｍＬ；Ｌ２為測(cè)定時(shí)的用液量，ｍＬ；Ｍ０為試樣的質(zhì)量，ｇ；ｍ為試樣干物質(zhì)含量，％；Ａ為試樣的吸光度；１．９７５為用１０ ｍｍ比色杯，當(dāng)吸光度等于０．５０時(shí)，每毫升茶湯中含茶多酚相當(dāng)于１．９７５ ｍｇ。

１．２．５抗氧化能力的測(cè)定

１）ＤＰＰＨ自由基清除力測(cè)定。參照文獻(xiàn)［１８，１９］ＤＰＰＨ自由基清除力的測(cè)定方法，準(zhǔn)確稱量０．０３９ ４ ｇ ＤＰＰＨ，無水乙醇定容至５００ ｍＬ容量瓶中，得到濃度為０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＰＰＨ無水乙醇溶液，４ ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

分別吸取不同濃度的樣品和無水乙醇溶液２．０ ｍＬ，加入０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＰＰＨ無水乙醇溶液２．０ ｍＬ，搖勻后，于室溫黑暗處放置３０ ｍｉｎ。以無水乙醇調(diào)零，測(cè)定５１７ ｎｍ處的吸光值Ａ樣品； 同時(shí)，測(cè)定樣品溶液２．０ ｍＬ與無水乙醇２．０ ｍＬ混合液在５１７ ｎｍ處的吸光值Ａ空白，再測(cè)定ＤＰＰＨ無水乙醇溶液２．０

ｍＬ與無水乙醇２．０ ｍＬ在５１７ ｎｍ處的吸光值Ａ對(duì)照， 同一測(cè)定均重復(fù)３次。ＤＰＰＨ自由基清除率的計(jì)算公式如下。

２）還原力測(cè)定。參照豆海港等［２０］的方法，?。埃?ｍＬ不同的樣品液和４０％乙醇水溶液，分別加入２．５ ｍＬ磷酸緩沖液（ｐＨ６．６，０．２ ｍｏｌ／Ｌ）及２．５ ｍＬ １％ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６，于５０ ℃水浴中反應(yīng)２０ ｍｉｎ后迅速冷卻，并加入２．５ ｍＬ １０％的三氯乙酸溶液，以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ后取上清液２．５ ｍＬ，并加入２．５ ｍＬ去離子水及０．５ ｍＬ ０．１％ ＦｅＣｌ３溶液，混合均勻，于１０ ｍｉｎ后以空白樣品調(diào)零，測(cè)定各樣品７００ ｎｍ的吸光度。

２結(jié)果與分析

２．１ 普洱茶優(yōu)勢(shì)菌種分離鑒定結(jié)果

通過對(duì)普洱茶中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)分離與純化，經(jīng)顯微鏡鏡檢和真菌鑒定手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照，初步鑒定得到的菌種有黑曲霉、根曲霉、青霉和酵母菌。

２．２ 發(fā)酵過程中茶多酚變化規(guī)律

在整個(gè)茶葉發(fā)酵過程中多酚的含量都呈下降的趨勢(shì)，不同的菌種，多酚下降的趨勢(shì)不同。自然發(fā)酵相對(duì)于人工接種發(fā)酵的茶葉中多酚下降速度緩慢。由圖１可知，在茶葉發(fā)酵過程中接種黑曲霉，多酚含量呈下降趨勢(shì)，在前６ ｄ變化趨勢(shì)較明顯；在黑曲霉、酵母菌的作用下，茶葉發(fā)酵過程中多酚含量呈明顯的下降趨勢(shì)。在黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉４種微生物的混合發(fā)酵作用下隨著茶葉發(fā)酵過程的進(jìn)行，茶葉中多酚含量呈明顯的下降趨勢(shì)。茶葉在未接種自然發(fā)酵的條件下，茶多酚含量呈下降趨勢(shì)，但是下降趨勢(shì)較緩慢。處理１相對(duì)于處理２與處理３來說，茶葉發(fā)酵過程中多酚含量下降的較緩慢，雖然接種的菌種量一樣，但是處理１的茶葉僅接種了黑曲霉，而其他的接種了多種菌。處理２與處理３相比較，一周后處理２的茶多酚含量的下降趨勢(shì)比處理３下降的速度要快，可能是黑曲霉和酵母菌在茶葉發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，而在接種時(shí)，接種的總菌種量是一定的，處理２中黑曲霉和酵母菌所占的比例較大。

２．３ＤＰＰＨ自由基清除率測(cè)定

根據(jù)各樣品的吸光度值，計(jì)算ＤＰＰＨ自由基清除率，如圖２所示。由圖２可知，從總體上看，在發(fā)酵初期，各處理提取液樣品對(duì)ＤＰＰＨ自由基的清除率逐漸升高，發(fā)酵到９ ｄ以后，樣品對(duì)ＤＰＰＨ自由基的清除率急劇下降。對(duì)于由單一菌種發(fā)酵的處理１來說，其發(fā)酵產(chǎn)物的ＤＰＰＨ自由基的清除率逐漸升高，９ ｄ達(dá)到最大值９０．９０％，之后逐漸降到發(fā)酵前的初始值８３．９９％以下。對(duì)于混合菌種接種發(fā)酵的處理２和處理３來說，在發(fā)酵后３ ｄ就分別達(dá)到最大值９０．０６％和９３．０９％，９ ｄ以后，也降低到發(fā)酵前的初始值以下。而作為對(duì)照的自然發(fā)酵處理，由于缺乏優(yōu)勢(shì)菌種的作用，其ＤＰＰＨ自由基的清除率增長較慢，３ ｄ達(dá)到最大值８７．１１％，然后便一直減小，至６ ｄ后便降至發(fā)酵前的初始值以下。

２．４還原力變化趨勢(shì)

記錄各處理樣品７００ ｎｍ的吸光值，表示其還原力的大小，結(jié)果見圖３。由圖３可以看出，對(duì)于由單一菌種發(fā)酵的處理１來說，其發(fā)酵產(chǎn)物的還原力逐漸增高，９ ｄ達(dá)到最大值０．６０８，之后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。對(duì)于混合菌種接種發(fā)酵的處理２和處理３來說，在發(fā)酵的３ ｄ就達(dá)到最大值０．５９３和０．７１２，到９ ｄ以后，逐漸降低到發(fā)酵前的初始值０．４８９以下。而作為對(duì)照的自然發(fā)酵的處理，由于缺乏優(yōu)勢(shì)菌種的作用，其還原力增長較慢，６ ｄ達(dá)到最大值０．５１８，之后便降至發(fā)酵前的初始值以下。這說明隨著發(fā)酵過程的繼續(xù)，樣品提取液的還原力在不斷地發(fā)生變化，各處理樣品的還原力先增大后減小。這與ＤＰＰＨ法測(cè)試結(jié)果相一致。

３結(jié)論

從普洱茶中分離純化得到的菌種有黑曲霉、根曲霉、青霉和酵母菌，這與方祥等［6］的研究結(jié)果一致。本研究中，茶葉在發(fā)酵過程中，不同的菌株對(duì)茶葉的發(fā)酵效果不同，多酚的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力隨時(shí)間的增加先增大后減小。其中接種兩種菌（黑曲霉、酵母菌）和接種４種菌（黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉）的茶葉中多酚含量變化趨勢(shì)明顯，分別降低了８２．９３％和７６．４１％。在接種量相同的條件下，接種黑曲霉、酵母菌的茶葉在發(fā)酵過程中，多酚含量下降的速度較快。其中接種黑曲霉，其發(fā)酵產(chǎn)物的ＤＰＰＨ自由基的清除率和還原力在發(fā)酵后9 d達(dá)到最大值，而自然發(fā)酵樣品的抗氧化能力卻緩慢增加至最大值而后迅速下降。接種有黑曲霉、酵母菌2種和黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉4種混合菌種的樣品，能夠在３ ｄ的發(fā)酵期內(nèi)達(dá)到ＤＰＰＨ自由基的清除率和還原力的最大值，并且保持到９ ｄ后才下降到初始值之下。這說明茶葉發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性不僅與多酚的含量有關(guān)，而且和多種菌種共生協(xié)同作用有關(guān)。本研究通過接種不同的菌種，初步揭示了茶葉發(fā)酵過程中多酚的變化規(guī)律及提取物抗氧化活性變化趨勢(shì)，這為進(jìn)一步深入研究茶葉人工發(fā)酵菌種的選擇和開發(fā)利用其抗氧化性產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、安全、質(zhì)量統(tǒng)一的發(fā)酵茶提供了理論依據(jù)。

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