王偉飛 王新穎 岳 輝 毛正果 陳培生

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，大腸癌的發(fā)病率男女均處于惡性腫瘤的第3位［1］，在我國，大腸癌的發(fā)病呈逐年上升趨勢。研究表明，大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個典型的多基因多步驟的癌變過程［2］。CD24是1種黏蛋白樣高度糖基化的膜表面黏附分子，近年研究發(fā)現(xiàn)其在多種造血系統(tǒng)腫瘤及實體瘤中呈高表達［3］，而且CD24的胞質(zhì)表達與乳腺癌［4］、膽管癌［5］、胃癌［6］、腎透明細胞癌［7］及前列腺癌［8］等腫瘤的預后密切相關(guān)。在大腸癌中，90.7%腺瘤和86.3%腺癌表達CD24［9］，這提示在大腸癌的早期階段已經(jīng)發(fā)生CD24的改變，說明CD24可能參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。因此，本研究檢測CD24在大腸癌組織及細胞株中的表達情況，并通過構(gòu)建CD24真核細胞表達質(zhì)粒，初步探討CD24對大腸癌SW480細胞生長增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 收集我院 2007年7月～2008年12月、手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實的大腸癌及癌旁組織標本106例，所有病例均經(jīng)病理檢查確診，且排除合并有其它惡性腫瘤和手術(shù)前接受化療或放療的患者。全部病例中，男性65例，女性41例，年齡26～87歲，中位年齡59歲。按WHO腫瘤分類標準(大腸癌)進行組織學分型:高分化腺癌23例，中分化腺癌70例，低分化腺癌13例。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)聯(lián)合制定的標準(2003年)進行TNM分期:Ⅰ期16例，Ⅱ期37例，Ⅲ期37例，Ⅳ期16例。

1.1.2 細胞株及試劑 大腸癌細胞株 SW1116、SW480、SW620、HCT8、LoVo及 Colo205 為本實驗室儲存，RPMI 1640及胰酶購自GIBCO公司，胎牛血清及青鏈霉素購自杭州四季青生物公司，Trizol、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000均購自invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自立陶宛MBI(Fermentas)公司，PCR反應體系購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，正常腸組織cDNA文庫由南方醫(yī)院消化內(nèi)科王繼徳教授贈送，核酸純化試劑盒購自德國Macherey-Nagel(MN)公司，內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ及連接酶購自美國NEB公司，感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司，CD24 Ab-1(Clone SN3)單克隆抗體購美國 Neomarker公司，CD24(C-20)和FITC標記的二抗購自美國Santa cruz公司，HRP標記二抗均購自武漢博士德生物公司，細胞增殖試劑盒CCK8購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，免疫組化用SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和防脫玻片購自福州邁新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 CD24表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù) GenBank中人CD24基因(基因編號:NM 013230)設(shè)計引物，以正常腸黏膜cDNA文庫為模板擴增cDNA編碼區(qū)，上下游引物分別是5’-TAGGTACCACTATGGGCAGAGCAATGG-3’(F)和 5’-CCGGAATTCCGTTAAGAGTAGAGATGC-3’(R)，PCR反應體系為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應。PCR產(chǎn)物及空質(zhì)粒按說明書使用EcoRⅠ和kpnⅠ雙酶切后純化連接，之后進行轉(zhuǎn)化，挑單克隆增菌后提取質(zhì)粒，雙酶切及測序鑒定。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染 上述大腸癌細胞株使用含100 ml/L胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。細胞生長至約85%融合時使用胰酶(0.05%，w/v)/EDTA(0.02%，w/v)進行傳代。細胞轉(zhuǎn)染操作按Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行，在六孔板上轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)，實驗組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-CD24。轉(zhuǎn)染后48 h處理細胞，應用RT-PCR和流式細胞術(shù)進行鑒定。

1.2.3 RT-PCR分析 收集的細胞用冰預冷的PBS緩沖液沖洗3遍后，按Trizol的說明書提取總RNA，采用分光光度計進行定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA后進行PCR擴增，PCR反應體系為94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，36個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應。CD24的上下游引物分別為5’-GACATGG GCAGAGCAATGGTGGC-3’(F)和 5’-GAGTGAGACCACGAAGAGACTGGC-3’(R)［10］。實驗重復3 次，同時擴增 GADPH 作為內(nèi)參照。

1.2.4 流式細胞術(shù) 0.05%胰酶消化細胞，按2×105個/ml的密度重懸細胞，按1∶100的工作濃度加入CD24 單克隆抗體(Ab-1，Neomarker)，冰上孵育 1h，用含有3%FBS的PBS緩沖液洗滌2次后，按1∶200的工作濃度加入FITC標記的二抗，冰上40 min，洗滌重懸后用流式細胞儀分析。同時以同型IgG作為陰性對照。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖 0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的SW480細胞、SW480-Vector細胞和SW480-CD24細胞后，用培養(yǎng)基制成單細胞懸液(3×105個/ml)，接種于 96 孔培養(yǎng)板中(100 μl/孔)，分別在轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h時進行檢測。每組各設(shè) 6孔，在檢測時更換新鮮培養(yǎng)基，同時加入CCK-8(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃孵育培養(yǎng)2 h后，應用酶聯(lián)免疫標記分析儀測定，用只加培養(yǎng)基的空白對照孔進行調(diào)零，每孔450 nm波長的吸光度OD值(OD450)，記錄結(jié)果，以時間為橫軸、吸光值為縱軸繪制細胞生長曲線，實驗重復3次。

1.2.6 免疫組織化學染色及結(jié)果判定 上述標本離體后經(jīng)10%中性福爾馬林液固定24～48 h，取材，常規(guī)脫水、透明和包埋，切片，厚度為4 μm，組織蠟片置于預先涂有多聚賴氨酸的載玻片烤干備用。采用免疫組化SP方法，按照免疫組織化學常規(guī)步驟操作。一抗CD24(C-20)按1∶400稀釋后4℃過夜。用已知陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

CD24陽性表達者細胞膜和細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。判定標準:每張切片隨機選取5個不同高倍視野(400×)進行觀察。染色結(jié)果綜合染色強度及陽性細胞百分數(shù)兩個方面進行半定量分析。指標染色強度判定:無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細胞百分數(shù)判定:陽性細胞百分數(shù)＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～75%為2分，＞75%為3分。將染色強度與陽性細胞百分數(shù)分值相加即為切片各指標最終得分:0～1分為陰性(－)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(+ +)，5～6分為強陽性(+ + +)。所有切片采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師獨立閱片評分。

1.3 統(tǒng)計學分析

結(jié)果均應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果取3次結(jié)果的平均值，增殖實驗取3次實驗結(jié)果中的1次作為統(tǒng)計結(jié)果，采用析因設(shè)計的方差分析;免疫組化中CD24染色強度(等級資料)與患者性別、年齡和腫瘤部位的關(guān)系分析采用非參數(shù)秩和檢驗，而表達強度與TNM分期和腫瘤分級的關(guān)系分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CD24在大腸癌組織中的表達

CD24在大腸癌組織中的染色定位在細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒樣染色，而在癌旁正常黏膜中幾乎無染色。CD24膜表達陽性率為34.9%，表達水平與腫瘤分級呈負相關(guān)(γ = －0.201，P=0.038)，而與患者性別、年齡及腫瘤分期無相關(guān)性(表1)。CD24質(zhì)表達陽性率為89.6%，其表達水平與腫瘤分級(γ=0.235，P=0.015)和腫瘤分期(γ =0.269，P=0.005)呈正相關(guān)性，與患者性別、年齡及腫瘤部位無相關(guān)性(表2)。

2.2 CD24在大腸癌細胞株中的表達

采用 RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，CD24在 SW620和Colo205細胞中呈高表達，在SW1116細胞中呈中度表達，而在SW480、HCT8和LoVo細胞中幾乎無表達。進一步應用流式細胞術(shù)從蛋白質(zhì)水平檢測CD24的表達，其結(jié)果與采用RT-PCR法檢測的結(jié)果一致。

2.3 構(gòu)建CD24表達質(zhì)粒并瞬時轉(zhuǎn)染SW480細胞

對重組質(zhì)粒進行雙酶切(EcoRI和KpnI)，得到265 bp的片段，與預計片段大小一致，而空載體沒有相應條帶(圖1A);質(zhì)粒測序證實重組質(zhì)粒插入片段與Genebank的序列完全一致。上述結(jié)果提示CD24在SW480細胞中呈低表達，故選擇轉(zhuǎn)染SW480細胞使其過表達CD24，同時轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對照。如圖1B所示，RT-PCR檢測結(jié)果提示，CD24在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中呈高表達，而在空白對照組和空載體組中呈低表達。應用流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD24重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在蛋白質(zhì)水平也呈明顯的高表達(圖1C)。

表1 CD24膜表達與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

表2 CD24質(zhì)表達與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

圖1 構(gòu)建pcDNA3.1(+)-CD24表達質(zhì)粒并瞬時轉(zhuǎn)染SW480細胞

2.4 CCK-8法檢測大腸癌細胞的增殖情況

增殖實驗分為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染空載體組(陰性對照組)和試劑組(空白對照組)，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h應用 CCK-8法測定細胞活性情況。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組細胞在轉(zhuǎn)染48、72和96 h時，活性均較陰性對照組和空白對照組明顯增強(P＜0.001)(圖2)，提示CD24促進大腸癌SW480細胞的增殖。

圖2 CD24促進大腸癌細胞的增殖曲線圖

3 討論

CD24通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定在細胞膜上，具有多個N-或O-連接的糖基化位點。而且，CD24分子在進化中獲得了更多的絲氨酸和蘇氨酸殘基，使其成為更典型的黏蛋白樣膜表面黏附分子［3］。P-選擇素是CD24已經(jīng)被識別的唯一配體［11］，它主要表達在激活的內(nèi)皮細胞和血小板上［12］。在生理狀態(tài)下，CD24通過和P-選擇素結(jié)合促進腫瘤細胞黏附在血管內(nèi)皮細胞上［13］，并促進腫瘤細胞在肺部形成轉(zhuǎn)移灶［14］。因此，CD24的結(jié)構(gòu)決定其與腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

在本研究中，我們應用免疫組化方法，檢測大腸癌及癌旁正常組織中CD24的表達情況，結(jié)果表明，CD24在大腸癌組織中呈高表達，質(zhì)表達和膜表達陽性率分別為89.6%和34.9%，而在癌旁正常黏膜中幾乎沒有表達。而且，CD24的質(zhì)表達水平與腫瘤分級分期呈正相關(guān)關(guān)系。這表明CD24在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。

Baumann等［15］發(fā)現(xiàn)高表達CD24不僅促進乳腺癌和胰腺癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附、遷移和侵襲，而且，體內(nèi)和體外實驗都顯示其促進癌細胞的生長和增殖。Smith等［16］應用siRNA干擾技術(shù)降低CD24的表達后，膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌細胞的增殖明顯受到抑制。在本研究中，為了進一步驗證CD24對大腸癌細胞生物學行為的影響，我們構(gòu)建了CD24的表達質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-CD24，并選擇 CD24低表達的SW480細胞作為轉(zhuǎn)染對象。結(jié)果表明，過表達CD24后SW480細胞在體外的生長和增殖明顯加快，這說明CD24不僅與腫瘤的遷移和黏附有關(guān)，而且，與腫瘤細胞的增殖也密切相關(guān)。但是，CD24促進癌細胞增殖的機制并不清楚。Kim等［17］發(fā)現(xiàn)CD24對乳腺癌細胞的增殖作用可能與CyclinD1和p27有關(guān)。連續(xù)切片的免疫組化染色表明，在膽管癌組織中CD24表達與p-MAPK呈明顯的負相關(guān)關(guān)系［5］。這些研究說明CD24可能通過細胞內(nèi)的某些信號分子促進腫瘤細胞的增殖作用。

總之，本研究表明CD24在大腸癌的組織中呈高表達，而且可促進大腸癌細胞在體外的增殖作用，這說明CD24在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。但是，其發(fā)生作用的具體機制并不清楚，包括相互作用的分子、結(jié)構(gòu)以及與細胞內(nèi)信號通路的關(guān)系，因此，需要進一步深入研究。

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