劉曉玲 宋振川 李 勇 肖建偉 郭宸君

DC的激活是機體抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)，DC在外周血中含量極少，分離純化困難。探究小鼠骨髓樹突狀細胞制備的相關(guān)流程、添加GM-CSF、IL-4、TNF-α的劑量、時機、孵育時間，通過形態(tài)學(xué)觀察及流式細胞儀檢測其表面標(biāo)志物以鑒定DC的成熟情況，探索提高DC的產(chǎn)量和純度的方法。采用(MTT)比色法測定DC對胃癌細胞的體外殺傷作用，探討樹突狀細胞腫瘤免疫機制，為臨床進一步研究與應(yīng)用DC進行胃癌的免疫治療提供佐證。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物

胃癌細胞株:615小鼠前胃癌細胞株(MFC)購于中科院上海細胞生物研究所，采用10%FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液傳代。SPF級615小鼠，雌雄各半，鼠齡6～8周，體重17～21 g，購于天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所實驗動物中心，動物合格證號:SCXK(津)2004-0001。所有小鼠購回后飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 樹突狀細胞的培養(yǎng)和細胞形態(tài)學(xué)觀察

頸椎脫臼法處死615小鼠，浸入75%乙醇無菌取股骨，剝除肌肉，浸泡于PBS液中。剪開骨兩端，PBS液反復(fù)沖洗髓腔。骨髓細胞懸液400目濾網(wǎng)過濾。離心去上清，加入紅細胞裂解液吹打，加入PBS終止反應(yīng)，再離心清洗。細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，加GMCSF(終質(zhì)量濃度20 ng/ml)孵箱中培養(yǎng)。第3天吸去培養(yǎng)液及懸浮細胞，保留貼壁細胞，加入新鮮等量RMPI-1640全培養(yǎng)液和相同濃度的GM-CSF及終濃度為10 ng/ml的IL-4，隔日半量換液，補充RMPI-1640全培養(yǎng)液和GM-CSF及IL-4至第8天，加入TNF-α(10 ng/ml)，再培養(yǎng)48 h，收獲成熟的小鼠骨髓來源樹突狀細胞。相差顯微鏡下，觀察六孔板中培養(yǎng)第1、3、5、7、8、10天樹突狀細胞的大小、形態(tài)、數(shù)量、分布、貼壁情況、細胞集落的生長狀況，并拍照。

1.3 DC細胞表面標(biāo)志物的檢測

分別收集加入TNF-α前及加入TNF-α 48 h后的DC懸液，離心去上清。加入FITC anti-mouse CD11c、PE anti-mouse CD86單抗，流式細胞儀檢測各組DC表面CD11c、CD86的表達。

1.4 MTT法檢測樹突狀細胞對胃癌細胞的體外殺傷活性

615小鼠胃癌細胞株MFC培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)第11天的DC，加入含有胃癌細胞的96孔板中 (10∶1、20∶1、30∶1)。另外單獨加入與效靶比同濃度的DC、胃癌細胞及1640培養(yǎng)液，每組5孔，設(shè)為對照組，共兩板。其一孵箱培養(yǎng)24 h，其二孵箱培養(yǎng)48 h，酶標(biāo)儀570 nm測OD值，計算DC的殺傷活性。

2 結(jié)果

經(jīng)分離提純的小鼠骨髓細胞，培養(yǎng)24 h后，相差顯微鏡下可見到培養(yǎng)板底部有體積小、圓形、無明顯突起的半貼壁細胞，少量細胞集落形成;體外培養(yǎng)3天后貼壁細胞逐漸增多，松散黏附于培養(yǎng)板的細胞集落增多，散在少量DC，半貼壁，細胞體積較前有所增大，細胞核可見，呈小圓或橢圓形?？梢娰N壁的單核巨噬細胞;體外培養(yǎng)第5天可見部分細胞脫壁，從細胞集落中釋放出來，呈半貼壁狀態(tài)，細胞體積變大，形狀不規(guī)則，呈星狀、蝌蚪狀、梭形，有部分突起，即為未成熟DC細胞;體外培養(yǎng)第7天，細胞體積較前一天增大，培養(yǎng)液中有更多懸浮細胞，細胞集落散在，形狀趨于星形，有2～5個不等的突起，有的較長，但仍為梭形，其懸浮細胞為擴增之骨髓樹突狀細胞。加入TNF-α 24 h后，大量形態(tài)典型的DC從集落釋放，細胞生長旺盛，細胞體積增大，突起粗大且較長，胞體相對飽滿，細胞形態(tài)呈星形、多邊形或梭形。每只615小鼠平均能分離出3×107個骨髓細胞，經(jīng)培養(yǎng)可獲得約7×106個DC細胞。

將加入TNF-α前后組作為實驗組，將未加抗體的DC作為對照組，DC表面標(biāo)志物CD11c陽性表達率加入 TNF-α 前為(65.09 ±3.04)%，加入 TNF-α 后為(70.99 ±1.44)%(χ2=6.625;P=0.097);CD86 陽性表達率加入 TNF-α 前為(25.80±0.30)%，加入 TNF-α 后為(55.91 ±2.41)%(χ2=6.856;P=0.032)，加入TNF-α前后CD86陽性表達率比較差異有顯著性，CD11c陽性表達率加入 TNF-α前后無差別(P ＞0.05)。

DC與615小鼠胃癌細胞共孵育24 h，MTT法檢測，當(dāng)效靶比分別為10∶1、20∶1、30∶1時，DC對胃癌細胞的體外殺傷活性分別為(22.62±2.94)%、(45.75 ±1.48)%和(74.24 ±0.34)%，三組間比較差異有顯著性(χ2=13.997;P=0.036)。共孵育 48 h，DC對胃癌細胞的殺傷活性分別為:(28.32±3.27)%、(50.77 ±0.53)%和(79.90 ±2.65)%，三組間比較差異有顯著性(χ2=13.420;P=0.037)。孵育24 h與孵育48 h各等效靶比組間比較，DC對胃癌細胞的殺傷活性無明顯差別;對照組中DC對胃癌細胞的殺傷活性比較差異無顯著性(P＞0.05)。

3 討論

DC來源于骨髓CD34+細胞［1］。GM-CSF是維持DC發(fā)育及分化最根本的細胞因子［2］。研究表明用來誘導(dǎo)DC的GM-CSF濃度提高到20 ng/ml，同時延長培養(yǎng)時間，可獲得更多DC(達1×108～3×108個/鼠，純度也達85%以上)，當(dāng)GM-CSF濃度大于20 ng/ml時，將會誘導(dǎo)出嗜酸性粒細胞集落的形成［3］，當(dāng)GMCSF的濃度達到40～80 ng/ml時，巨噬細胞集落和紅細胞集落將會大量增加?？梢娫趩为毷褂肎M-CSF誘導(dǎo)DC分化時濃度最佳點可能就是20 ng/ml。IL-4能抑制培養(yǎng)物中巨噬細胞和中性粒細胞的產(chǎn)生，并能使DC具有典型形態(tài)和很強的處理外源性抗原能力［4］。

小鼠骨髓來源的DC前體細胞，在細胞因子的催化下分化為非成熟DC，細胞表面較高表達與吸收和加工抗原有關(guān)的分子，如CD1A、CCR6。當(dāng)DC細胞完成抗原加工功能，向次級淋巴器官遷徙的過程中而成為成熟DC。成熟的DC表達高水平MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子、協(xié)同刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子(CO40、CD44、CD54)、整合素及特征性標(biāo)記(CDla、CD1lc、CD83)等［5］。

樹突狀細胞(dendritic cell，DC)除了可以通過特異性腫瘤單克隆抗體(McAb)介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)，增強殺傷腫瘤細胞的活性，激活并調(diào)控T淋巴細胞的免疫功能外，還有直接殺傷腫瘤細胞的生物學(xué)活性。

Shimamuraa等［6］發(fā)現(xiàn)髓系DC也可在體外直接殺傷纖維母細胞瘤MCA205。DC不分泌INF-r和TNF-α等殺傷因子，但分泌一氧化氮(NO)合成酶抑制劑可部分阻止瘤細胞的凋亡，因而認為DC通過NO機制誘導(dǎo)瘤細胞的凋亡，并且不需要 DC-瘤細胞直接接觸。Yang等［7］研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者單核細胞來源的未成熟DC，可通過鈣依賴的Fas/FasL機制誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡。

DC直接殺傷腫瘤細胞的確切機制尚不十分清楚，目前已有的研究提示:DC與腫瘤作用后腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，誘導(dǎo)細胞凋亡被認為是DC殺傷腫瘤細胞的一個重要機制;DC直接殺傷活性除與其成熟度有關(guān)外，還與腫瘤細胞株的組織來源及刺激因子的種類有關(guān)［8］;Lu 等［9］報道 DC 表面的 TNF 家族中 TNFα、FasL和TRAIL均與DC的直接抗腫瘤活性有關(guān)。

本實驗采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，測定了小鼠成熟骨髓來源DC對小鼠胃癌細胞的體外殺傷作用。在混合培養(yǎng)24、48 h后，DC對胃癌細胞的殺傷作用隨效靶比的增大而增強，進而證明了樹突狀細胞對腫瘤細胞的直接殺傷作用。共孵育24 h與48 h比較，DC對胃癌細胞的殺傷活性有增強趨勢，但無顯著差異，為獲取最佳共孵育時間提供依據(jù)。

綜上所述，樹突狀細胞(DC)作為體內(nèi)專職抗原遞呈細胞，腫瘤抗原負載的DC回輸入體內(nèi)，能激發(fā)特異細胞免疫反應(yīng)，增強機體抗腫瘤能力。為了臨床研究的需要，從小鼠骨髓獲得大量DC十分必要。本研究經(jīng)提取小鼠骨髓細胞以GM-CSF聯(lián)合IL-4終末添加TNF-α培養(yǎng)，獲得了具有典型形態(tài)學(xué)特征及生物學(xué)特征的DC，建立了獲取大量小鼠骨髓成熟樹突狀細胞的體外擴增培養(yǎng)方法。MTT法顯示小鼠骨髓DC對胃癌細胞具有直接殺傷作用，本研究不僅為DC的體外培養(yǎng)提供了有效方法，而且為應(yīng)用DC對胃癌進行免疫治療提供了證據(jù)。

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