張彥龍
(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,哈爾濱 1 5 0 0 4 0)
在哺乳動(dòng)物中生物體內(nèi),存在二種主要的硫酸化糖脂質(zhì),一種是大腦的神經(jīng)鞘(sphingolipid)的硫酸鹽半乳糖神經(jīng)酰胺(sulfated galactosylceramide)也稱之為硫酸糖脂質(zhì)(galactosylsulfatide,SM4s;Sulfatide),在髓鞘(myelin sheath)中有較高的含量;另一種是存在于雄性生殖細(xì)胞的硫酸鹽半乳糖烷基甘油酯(sulfated galactosylalkylacylglycerol),稱之為是精原糖脂質(zhì)(seminolipid,SM4g),精原糖脂質(zhì)較高的表達(dá)在從精母細(xì)胞到精子細(xì)胞的各個(gè)階段的生殖細(xì)胞。它們基本結(jié)構(gòu)硫酸根是由前體PAPA(3′-phosphoadennosine 5′-phosphosufate),通過(guò)它們共同的轉(zhuǎn)移酶—腦苷脂硫酸轉(zhuǎn)移酶(cerebroside sulfotransferase,CST)催化下,在高爾基膜上將PAPA上的硫酸根轉(zhuǎn)移到乳糖環(huán)的三位上,形成硫酸化的糖脂質(zhì)[1,2]。
CST已成功的從人的腎癌細(xì)胞中精制,并且cDNA被克隆,CST基因突變鼠出現(xiàn)部分神經(jīng)紊亂,生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂前期停止分化而凋亡,導(dǎo)致雄性的不孕。Northern雜交證明在小鼠的腎臟、腦、睪丸、胃、小腸、肝臟、肺中發(fā)現(xiàn)了它的mRNA,通過(guò)精原干細(xì)胞移植技術(shù),證明了在附睪中也有硫酸化糖脂質(zhì)的存在,但結(jié)構(gòu)和功能還有待解析[3~6]。在生殖細(xì)胞中糖脂質(zhì)存在于生殖細(xì)胞的表面,精子細(xì)胞的精原糖脂質(zhì)直接粘附在卵子的透明帶上,由此可能與受精有關(guān),但具體功能還不甚了解,在生殖細(xì)胞中詳細(xì)的功能還有待探討[3~7]。為進(jìn)一步研究硫酸化糖脂質(zhì)的生物學(xué)特性和功能,純化硫酸化的糖脂質(zhì)是開(kāi)展此項(xiàng)研究前提條件之一。
脂筏(lipid-raft)又稱膜的微小功能區(qū)(microdomain),這些微小功能區(qū)富集有鞘糖脂和膽固醇中,包括甘油磷酸肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI),它們共同和所黏附的蛋白作為細(xì)胞膜的旁系結(jié)構(gòu)組成部分的漂浮在細(xì)胞膜上的復(fù)合物,目前多項(xiàng)研究表明,具有蛋白的極性排列和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的功能[8~10]。作為硫酸化的精原糖脂質(zhì)在生殖細(xì)胞中是否以脂筏形式存在,是本研究目標(biāo)。
為此,我們從牛的睪丸中提取精原糖脂質(zhì),從小鼠的睪丸生殖細(xì)胞中提純脂筏,通過(guò)檢驗(yàn)證明精原糖脂質(zhì)以脂筏形式存在于小鼠睪丸的生殖細(xì)胞膜中,這個(gè)結(jié)果對(duì)于今后進(jìn)一步研究精原糖脂質(zhì)及其相結(jié)合蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性必將起到一定的推動(dòng)作用。
牛的睪丸;氯仿;甲醇;蔗糖;orcinol;DEAESephadex A-25,Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway,NJ);C57BL/6 小鼠;silica gel HP-K 板(10cm ×10 cm,250 μm ),Whatman Inc.(Clifton,NJ);Silica Gel 60 HPTLC plates(Merck);超速離心機(jī)(Beckman),轉(zhuǎn)子(SW40Ti)。
睪丸組織的處理:將牛的睪丸去除外膜,用刀切碎,稱取500 g,按10倍體積加入氯仿/甲醇=1/2混合液,在超生波中破碎組織并過(guò)夜攪拌,次日應(yīng)用二層濾紙過(guò)濾除去雜質(zhì)。
第一次DEAE-Sephadex A-25層析:離子交換柱先用甲醇洗滌一下,然后填充在甲醇中事先膨脹好的 DEAE-Sephadex A-25,總體積大約 110 cm3,應(yīng)用氯仿/甲醇/水=30/60/8平衡 DEAE-Sephadex A-25,總體積為1 L;加入經(jīng)濾紙過(guò)濾的牛睪丸樣本,應(yīng)用平衡液洗滌,體積為柱床體積的10倍以上。加入0.1 mil/L醋酸銨/甲醇,收集洗脫液,每個(gè)管50 ml。每個(gè)管取100 μl滴加到硅膠板上,應(yīng)用orcinol硫酸染色液染色鑒定,將含有硫酸糖脂質(zhì)的管收集到一起,得到粗提精原糖脂質(zhì)。將樣本粗體精原糖脂質(zhì)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮剩20 ml左右,加入200 ml去離子水,超聲波中分散粗提物,將樣本放入透析袋中除鹽,在4℃下透析,并換3~4次去離子水;將經(jīng)過(guò)透析的樣本加入乙醇,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮直至干燥,得到粗提的精原糖脂質(zhì)命名為Pre。
硅膠層析:硅膠懸浮在100%氯仿中,添加柱床上,并應(yīng)用氯仿平衡層析柱硅膠.濃縮的樣品溶解在氯仿中,經(jīng)超聲波10 min處理,然后低速離心,將上層液加入平衡好的硅膠柱中.應(yīng)用氯仿1 L洗滌,然后應(yīng)用500 ml的氯仿/甲醇=9/1混合液,除去非特異性的物質(zhì)。洗脫精原糖脂質(zhì),應(yīng)用1 500 ml的氯仿/甲醇=4/1洗脫,每管50 ml收集,每個(gè)管取100 μl,TLC檢驗(yàn),TLC展開(kāi)液為氯仿/甲醇=4/1。將含有精原糖脂質(zhì)的管收集,按上述方法濃縮直至干燥,之后溶解到氯仿/甲醇/水=30/60/8中。
第二次DEAE-Sephadex A-25層析:用氯仿/甲醇/水=30/60/8平衡 DEAE-Sephadex A-25的柱床中,加入溶解到氯仿/甲醇/水=30/60/8的樣本,用平衡液按10倍柱床體積洗滌,再用5倍的甲醇洗滌。精原糖脂質(zhì)洗脫,洗脫液為醋酸銨/甲醇,洗脫方法梯度洗脫 20 mil/L;40 mil/L;60 mil/L;80 mil/L;100 mil/L,每個(gè)管50 ml;每個(gè)管取100 μl除鹽后,TLC檢驗(yàn),展開(kāi)液為氯仿/甲醇=4/1,將含有精原糖脂質(zhì)的管收集,按上述方法濃縮直至干燥。
逆向?qū)游龀}:Sep-pak-C18和注射器連接,將濃縮的樣本溶解在水/甲醇=1/1,經(jīng)超聲溶解制成懸液.Sep-pak-C18平衡液分別為氯仿/甲醇=2/1,用量7 ml;甲醇 7 ml;水 30~50 ml.將樣本加入柱床中;用大于10 ml的水洗滌.洗脫液分別應(yīng)用甲醇3 ml;氯仿/甲醇=2/1用量6 ml,將洗脫液收集到一起,應(yīng)用氮?dú)獯蹈蓸颖?,?jīng)TLC檢驗(yàn)樣本純度。
小鼠生殖細(xì)胞的制備100個(gè)生后60 d的小鼠睪丸無(wú)菌采集,按著精原干細(xì)胞的制備方法[2],剝離睪丸去除睪丸被膜,取精細(xì)管PBS沖洗3次,置于32℃水浴搖床中,在0.25%/PBS胰蛋白酶消化20~30 min;DMEM沖洗,加入1 mg/ml膠原酶和200~500 μg/ml DNA酶作用20~30 min;吸管吹打使細(xì)胞分散,過(guò)55~77 μm尼龍篩濾過(guò)細(xì)胞,低速離心收集細(xì)胞,并用DMEM沖洗重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為105~106/ml,將細(xì)胞放于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM加10%FBS,培養(yǎng)條件為32℃。由于體細(xì)胞易貼壁生長(zhǎng),約6~7 h后晃動(dòng)培養(yǎng)瓶收集半懸浮細(xì)胞,即可獲得高濃度生殖細(xì)胞,離心回收細(xì)胞,用PBS洗滌3次備用。
制備方法按著脂筏不溶于去垢劑的原理和方法[13],在離心回收的生殖細(xì)胞中加入水解緩沖液(25 mMTris-HCI;PH7.5/0.15M NaCl,包 括 1%TritonX-100,1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride,1 mmol/L Na3Vo4,10 Trypsin inhibitor units/ml aprotinin5),在冰上應(yīng)用Teflon勻漿器反復(fù)勻漿細(xì)胞上下40~50次,然后將勻漿好的細(xì)胞加入蔗糖,調(diào)節(jié)蔗糖最終濃度40%,加入Beckman SW40Ti轉(zhuǎn)子的離心管中,每個(gè)離心管4 ml,之后加入30%、5%的蔗糖兩個(gè)梯度,每個(gè)梯度在4 ml,在4℃下39 000 r/min離心18 h。30%、5%蔗糖溶解液為細(xì)胞水解緩沖液。
將在離心管中不溶性的條帶分別回收放入1.5 ml的小管中,15 000 r/min離心15 min,再用PBS洗滌3次,最后沉淀物溶解到氯仿/甲醇/水=10/20/1,經(jīng)震蕩后在15 000 r/min下離心15 min,沉淀用于SDS-PAGE蛋白電泳鑒定,上清液在真空離心機(jī)蒸干后,經(jīng)Sep-pak-C18除鹽,濃縮后應(yīng)用TLC鑒定。
我們利用DEAE-Sephadex A-25和硅膠交替層析,從牛的睪丸提純出高純度的精原糖脂質(zhì)。在第一次應(yīng)用DEAE-Sephadex A-25提純,我們獲得了粗提的精原糖脂質(zhì),在經(jīng)硅膠層析厚,我們收集層析樣本,每個(gè)管 50 ml,每個(gè)管中提取 100 μl,經(jīng)濃縮后,在硅膠板上薄層層析展開(kāi),如圖1A中所示Pre代表第一次經(jīng)DEAE-Sephadex A-25粗提樣本,13-20表示是經(jīng)硅膠顆粒層析后,每個(gè)樣本收集50 ml洗脫液,取100 μl經(jīng)TLC展開(kāi)后,在orcinol硫酸染色的結(jié)果,從第13-20管有精原糖脂質(zhì)。在經(jīng)第2次DEAE-Sephadex A-25離子交換層析,按著不同濃度的硫酸銨洗滌,我們發(fā)現(xiàn),在60 mmol/L醋酸銨/甲醇洗脫下,在4~8管有精原糖脂質(zhì)的存在,并且經(jīng)Sep-pak-C18逆向?qū)游龀}后,我們點(diǎn)樣 5、10 μl后鑒定提純精原糖脂質(zhì)的純度,表明獲得較高純度的精原糖脂質(zhì),如圖3C所示。
按著制備精原干細(xì)胞的方法,制備生殖細(xì)胞懸液,這里包括精子形成過(guò)程中的各個(gè)階段的生殖細(xì)胞,在裂解液存在的下,應(yīng)用勻漿機(jī)裂解生殖細(xì)胞,將其加入蔗糖梯度的最底層,蔗糖最終濃度在40%,經(jīng)18 h超速離心后,我們可以看到兩條白色的帶,如圖2A所示,上層帶在5%和30%之間;下層帶在30%和40之間.回收兩條帶后,用有機(jī)溶劑分離脂筏,脂類部分經(jīng)濃縮除鹽后薄層層析鑒定,并和從牛睪丸中提純的精原糖脂質(zhì)比較,如圖2B所示,得到和提純精原糖脂質(zhì)分子量大小相等的兩條帶,上面的帶含有較多的精原糖脂質(zhì),下面的含量比較少。同時(shí)被分離的蛋白在12%濃度的SDS-PAGE電泳,經(jīng)銀染色證明有蛋白存在,由此說(shuō)明,精原糖脂質(zhì)和某種蛋白相結(jié)合,以脂筏的形式存在于睪丸的生殖細(xì)胞中。
圖1 D E A E-S e p h a d e x A-2 5和硅膠層析提純牛睪丸中的精原糖脂質(zhì),經(jīng)薄層層析(T L C)o r c i n o l硫酸染色的結(jié)果F i g.1 P u r i f i c a t i o n o f b o v i n e t e s t i c u l a r s e mi n o l i p i d
圖2 從雄性生殖細(xì)胞中經(jīng)蔗糖梯度離心提純的脂筏及其鑒定結(jié)果F i g.2 P u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f s e mi n o l i p i di nt h el i p i dr a f t o f t h e s p e r ma t o g e n i c c e l l me mb r a n e s
關(guān)于從牛睪丸中提純精原糖脂質(zhì),我們參考Juan G的方法并略作改進(jìn)[11],應(yīng)用DEAE-Sephadex A-25離子交換和硅膠顆粒層析相結(jié)合,并且應(yīng)用逆向?qū)游龀},經(jīng)薄層層析(TLC)鑒定,獲得高純的精原糖脂質(zhì).在提純過(guò)程中也發(fā)現(xiàn),按著文獻(xiàn)[11]所報(bào)道,在第一次離子交換后,粗提的精原糖脂質(zhì)在加10%甲醇的氯仿中溶解后,硅膠不能很好的吸附住精原糖脂質(zhì),(數(shù)據(jù)沒(méi)有展示),所以應(yīng)用純氯仿溶解精原糖脂質(zhì),得到較好的吸附效果;在第二次離子交換層析過(guò)程中,我們逐級(jí)增加醋酸銨的濃度,每個(gè)濃度洗脫液在300 ml,最終在60 mmol/L,洗脫出高純的精原糖脂質(zhì).經(jīng)TLC檢驗(yàn)及單克隆抗體染色(結(jié)果沒(méi)有展示)驗(yàn)證提純的為精原糖脂質(zhì)。
精原糖脂質(zhì)在哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞中占總糖脂的90%以上,缺少精原糖脂質(zhì)導(dǎo)致雄性的不孕[3];在受精中過(guò)程中,在精子細(xì)胞膜上以脂筏形式起著粘結(jié)作用[12,13]。但是還有許多不明之處,如在生殖細(xì)胞分化過(guò)程中功能及細(xì)胞信號(hào)如何傳導(dǎo),形成微小功能區(qū)所黏附蛋白分子有哪些,所以我們利用脂筏在去污劑不溶的特性,經(jīng)蔗糖梯度離心,提純出脂筏,從蔗糖梯度離心結(jié)果可知,發(fā)現(xiàn)有兩條帶在不同濃度的蔗糖中,上層條帶的蛋白要多于下面的條帶,可以預(yù)測(cè)精原糖脂質(zhì)在生殖細(xì)胞分化的不同時(shí)期有著不同的作用和功能,并黏附不同的蛋白分子.我們期待這些發(fā)現(xiàn)能夠解明精原糖脂質(zhì)所連接蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。
事先的研究已經(jīng)知道精原糖脂質(zhì)本質(zhì)上為生殖細(xì)胞所必需[2]。脂筏與膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選均有密切的關(guān)系[8]。我們這次從生殖細(xì)胞中提存了脂筏,并證明了精原糖脂質(zhì)包括在脂筏中,由此推測(cè)精原糖脂質(zhì)在生殖細(xì)胞細(xì)胞膜內(nèi),作為一個(gè)為受體信號(hào)傳導(dǎo)和運(yùn)輸?shù)墓δ苄云脚_(tái),并且作為脂筏的組成部分而發(fā)揮關(guān)鍵作用.下面的工作就是必須解明精原糖脂質(zhì)及其所結(jié)合的蛋白分子在生殖細(xì)胞膜上的分子生物學(xué)機(jī)制,這部分工作也已經(jīng)開(kāi)展,應(yīng)用提純的脂筏制備出單克隆抗體,希望通過(guò)此研究方法能夠鑒定出硫酸化糖脂質(zhì)所黏附的蛋白分子。
精原糖脂質(zhì)在哺乳動(dòng)物中除上述的生殖細(xì)胞一些生物學(xué)特性外,最近的研究表明,抗硫酸糖脂質(zhì)的單克隆抗體能封閉IAV[influenza A/WSN/33(H1N1)virus]和硫酸糖脂質(zhì)的結(jié)合,結(jié)果導(dǎo)致在核內(nèi)病毒的核蛋白蓄積而影響到IAV病毒的復(fù)制,保護(hù)小鼠對(duì)流感病毒的致死性[13]。由于無(wú)論是硫酸糖脂質(zhì)還是精原糖脂質(zhì)有共同的抗原結(jié)構(gòu),所以提純精原糖脂質(zhì),將來(lái)可用于制備單克隆抗體之用,雖然糖脂質(zhì)缺少免疫原性,這個(gè)問(wèn)題最近已經(jīng)通過(guò)制備突變鼠得到解決,應(yīng)用提純的精原糖脂質(zhì)免疫CST突變鼠,較容易的獲得單克隆抗體,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究得到證實(shí)[1]。
總之,硫酸化的糖脂質(zhì)在生物體內(nèi)的功能還有許多不明之處,通過(guò)對(duì)其脂筏的研究可進(jìn)一步幫助我們解決硫酸化糖脂質(zhì)的一些生物學(xué)功能,也對(duì)于研究其他脂質(zhì)所形成脂筏的生物學(xué)功能研究起到推動(dòng)作用。
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