黃波，王曉東，郎賢平

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121000）

小細胞肺癌是惡性度極高的腫瘤，早期即發(fā)生淋巴及血行轉(zhuǎn)移是其重要的臨床特點。小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移是多基因參與的復(fù)雜過程［1］。研究資料表明，ABCE1蛋白能夠阻斷干擾素介導(dǎo)的2-5A/核糖核酸酶L細胞抗病毒通路，并誘導(dǎo)前列腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，參與結(jié)腸癌的原始免疫應(yīng)答［2］，但ABCE1基因與肺癌及其轉(zhuǎn)移的相關(guān)報道較為罕見。因此我們構(gòu)建了含有新霉素Neo基因（可用G418篩選）且?guī)в芯G色熒光的ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA表達載體，并將其轉(zhuǎn)染入小細胞肺癌細胞，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ABCE1-siRNA的小細胞肺癌細胞株，為進一步研究ABCE1基因在小細胞肺癌中的作用打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人小細胞肺癌細胞株NCI-H446由中國科學(xué)院細胞庫引進。新生小牛血清購于杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和FUGENE HD購于美國Gibco公司。菌株E.coliDH5α購于上海閃晶生物公司。pRNAT-U6.1/Neo購于上海閃晶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA載體構(gòu)建：將合成的引物退火，95℃10 min后自然冷卻。將pRNA-U6.1/Neo載體用BamHI/HindⅢ雙酶切。使用DNA Ligation Kit將退火產(chǎn)物與pRNAT-U6.1/Neo載體4℃過夜連接。熱轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，分別命 名 為 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N，涂布平板后，37℃培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化平板上挑取白色陽性單菌落，提取質(zhì)粒并測序。

1.2.2 G418濃度的確定：將對數(shù)生長期的NCIH446細胞用胰酶消化，以3×105個/孔接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。鋪板第 2 日加入不同濃度的 G418（50、100、200、300、400、500 μg/ml），每 3 d 換液 1 次，換液同時加入G418，共培養(yǎng)3周。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及陽性克隆的篩選：轉(zhuǎn)染前1 d，NCI-H446細胞用胰酶消化，接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，當(dāng)細胞達到70%～80%融合時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換為無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)孔1 000 μl。取 FUGENE HD 10 μl，按照轉(zhuǎn)染試劑∶DNA（μg）為10∶2的比例加入構(gòu)建成功的載體DNA，混勻后室溫孵育30 min，加入到6孔板中培養(yǎng)，6 h后加入100 μl胎牛血清。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后，加入 G418（400 μg/ml）的培養(yǎng)液進行篩選，24 h后將轉(zhuǎn)染并進行篩選的細胞按1∶10的比例傳代，每3～5 d換液1次。繼續(xù)培養(yǎng)約1周待單克隆長到相對較大的集落后，于熒光顯微鏡下挑取細胞集落至24孔板。于24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，并繼續(xù)用 G418（200 μg/ml）的培養(yǎng)液進行篩選，約 3～5 d換液1次，待細胞長滿后，將仍有熒光的細胞轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)。6孔板長滿后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，取部分作Western blot之用，根據(jù)Western blot結(jié)果確定篩選效果。

1.2.4 Western blot鑒定陽性克?。菏杖〔糠旨毎?，加入預(yù)冷裂解緩沖液，剪碎，超聲勻漿，低溫超速離心。吸取上清液，Lowry法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠90 V電泳3 h后轉(zhuǎn)印。洗膜后1%BSA封閉非特異性抗原2 h。緩沖液洗膜，與一抗（1∶250）4℃孵育過夜。洗膜后與堿性磷酸酶標(biāo)記二抗（1∶200）室溫下孵育2h。NBT/BCIP顯色，以NC膜上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽性，終止顯色，漂洗并干燥后避光保存。

2 結(jié)果

2.1 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA載體的構(gòu)建及連接

ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N，涂布平板后，37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，測序并電泳，可見構(gòu)建的質(zhì)粒約6 500 bp大?。▓D1），選取陽性克隆的PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果與設(shè)計的序列一致（圖2）。

圖1 構(gòu)建后ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA質(zhì)粒電泳Fig.1 Identification of recombinant plasmid ABCE1-siRNA

圖2 構(gòu)建后ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.2 Sequencing analysis of recombinant plasmids and of the synthesized siRNA oligonucleotides

2.2 G418濃度的確定

將對數(shù)生長期的NCI-H446細胞用胰酶消化，接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。加入不同濃度的 G418（50、100、200、300、400、500 μg/ml），培養(yǎng)約 6 d 后可見各組均有細胞死亡，培養(yǎng)12 d后可見400、500 μg/ml G418組細胞均死亡，而其他組雖也有細胞死亡但未完全死亡，因此確定G418篩選濃度為400 μg/ml。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染及陽性克隆的篩選

應(yīng)用FUGENE-HD轉(zhuǎn)染48 h后可見ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N 轉(zhuǎn)染效率可達50%以上。因構(gòu)建的ABCE1-siRNA含有綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察細胞胞質(zhì)內(nèi)可見綠色的熒光（圖3），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后NCI-H446細胞略腫脹，部分細胞變圓、死亡。經(jīng) G418（400 μg/ml）篩選2周后，大多數(shù)細胞死亡，僅少數(shù)細胞存活，并形成克?。▓D4）。將形成克隆的細胞挑至24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)并用半量G418（200 μg/ml）篩選，培養(yǎng)約3周后，細胞形成較密集的克隆。將細胞消化傳代至6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)并用半量 G418（200 μg/ml）篩選，培養(yǎng)約2周后單個細胞均形成小克隆時，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，約3周后細胞長滿培養(yǎng)瓶（圖5）。收集細胞，部分細胞行Western blot鑒定。在篩選過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2后，細胞在篩選過程中增殖明顯減慢，證實干擾ABCE1基因后NCI-H446細胞增殖減慢。

圖3 轉(zhuǎn)染ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA 48 h的NCI-H446細胞×100Fig.3 NCI-H446 cells transfected with ABCE1-siRNA for 48hours×100

圖4 經(jīng)G418篩選2周后形成克隆的NCI-H446細胞 ×100Fig.4 Clonal NCI-H446 cells after screening two weeks by G418×100

圖5 擴大培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NCI-H446細胞 ×100Fig.5 Stable transfection NCI-H446 cells after expanding culture×100

2.4 ABCE1-siRNA對ABCE1蛋白表達的影響

Western blot檢測ABCE1蛋白表達水平，可見68 kDa處有1條特異條帶。凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描ABCE1現(xiàn)色條帶，轉(zhuǎn)染ABCE1-pRNAT-U6.1/NeosiRNA后，將篩選克隆并擴大培養(yǎng)的細胞與未轉(zhuǎn)染的細胞相比，ABCE1蛋白表達量明顯下降（圖6）。表明ABCE1-siRNA能夠抑制小細胞肺癌細胞ABCE1基因表達，同時表明ABCE1-siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入NCI-H446細胞株，并篩選出了沉默ABCE1基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

圖6 Western blot結(jié)果Fig.6 Western blot of ABCE1

3 討論

小細胞肺癌的發(fā)生是一個多因素、多階段的過程。盡管放療、化療、生物治療以及手術(shù)治療在治療小細胞肺癌方面取得了一定的進展，但小細胞肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是一個巨大的難題［3］。目前己經(jīng)初步認(rèn)識到小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移是人體細胞基因組結(jié)構(gòu)和功能異常所致。

ABCE1基因定位于常染色體4q31上，屬于ATP結(jié)合盒多基因家族成員之一。它在真核細胞胞質(zhì)內(nèi)編碼一種名為核糖核酸酶L（ribonuclease L，RNase L）抑制因子的68 kDa蛋白，能夠阻斷干擾素介導(dǎo)的2-5A/核糖核酸酶L細胞抗病毒通路，抑制細胞凋亡過程，并可在促進蛋白質(zhì)合成及細胞增殖分化方面發(fā)揮作用［4］。RNA干擾是指在生物細胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引起與其同源mRNA的特異性降解，從而抑制其相應(yīng)基因表達的過程［5］。由于這種技術(shù)具有效率高、特異性強、顯效快、可以向子代遺傳和同時進行多基因研究等優(yōu)點，使其很快成為了基因研究的熱點。本研究構(gòu)建了ABCE1基因的siRNA表達載體ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2、ABCE1-pRNAT-U6.1/NeosiRNA-N。該載體含有Neomycin抗性基因作為篩選標(biāo)簽，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。同時該載體于起始端含有CMV啟動子，在CMV下方攜帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報告基因，可用于觀察轉(zhuǎn)染效率。將ABCE1-siRNA轉(zhuǎn)染入小細胞肺癌細胞NCI-H446，經(jīng)過G418篩選近3個月，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ABCE1的siRNA細胞株，經(jīng)Western blot鑒定達到持續(xù)沉默ABCE1的效果。

為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，細胞的轉(zhuǎn)染效率是十分關(guān)鍵的因素。轉(zhuǎn)染率太低不易篩選穩(wěn)定克隆，一般要求轉(zhuǎn)染效率要高于30%。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素有：（1）細胞狀態(tài)：健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)；（2）血清：無血清轉(zhuǎn)染時的轉(zhuǎn)染率明顯高于血清存在情況下的轉(zhuǎn)染率，因此在轉(zhuǎn)染前要去除血清；（3）DNA質(zhì)量：DNA 要高純度、無菌，最好是無內(nèi)毒素的；（4）轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例及培養(yǎng)時間：在本研究中按照FUGENE-HD說明書進行預(yù)實驗時，我們應(yīng)用了不同的脂質(zhì)體與核苷酸的比例，包括 5∶2，6∶2，7∶2，8∶2，9∶2，10∶2，12∶2。實驗結(jié)果證實，針對NCI-H446細胞進行FUGENE-HD轉(zhuǎn)染的可靠條件為：轉(zhuǎn)染時間為48 h時達到最大轉(zhuǎn)染率，脂質(zhì)體與核苷酸的用量比例為10∶2。本實驗通過以上細節(jié)的調(diào)整，轉(zhuǎn)染效率可達50%以上。為進一步獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆，我們應(yīng)用了G418進行篩選，篩選約2周左右可見單克隆形成。應(yīng)用200μl加樣槍挑取有熒光的單克隆后，繼續(xù)應(yīng)用G418（200μg/ml）篩選約2個月后，我們獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的成功篩選為進一步研究ABCE1基因?qū)π〖毎伟┑淖饔么蛳铝藢嶒灮A(chǔ)。

［1］Baines AT，Lim KH，Shields JM，et al.Use of retrovirus expression of interfering RNA to determine the contribution of activated K-Ras and ras effector expression to human tumor cell growth［J］.Methods Enzymol，2006，407（6）：556-574.

［2］Shea PR，Ishwad CS，Bunker CH，et al.RNASEL and RNASEL-inhibitor variation and prostate cancer risk in Afro-Caribbeans［J］.Prostate，2008，68（4）：354-359.

［3］Yano S，Zhang H，Hanibuchi M，et al.Combined therapy with a new bisphosphonate，minodronate（YM529）and chemotherap for multiple organ metastases of small cell lung cancer cells in severe combined immunodeficient mice ［J］.Clin Cancer Res，2003，9 （14）：5380-5385.

［4］Lingappa JR，Dooher JE，Newman MA，et al.Basic residues in the nucleocapsid domain of Gag are required for interaction of HIV-1 gag with ABCE1（HP68），a cellular protein important for HIV-1 capsid assembly［J］.J Biol Chem，2006，281（7）：3773-3784.

［5］Rodriguez-Lebron E，Paulson HL.Allele-specific RNA interference for neurological disease［J］.Gene Ther，2006，13（6）：576-581.