白云龍 王建杰

【摘要】目的 探討TLRs信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的調(diào)控作用。方法 用western blotting檢測(cè)乳腺癌MCF7細(xì)胞株與MDA-MB-231細(xì)胞株P(guān)D-L1蛋白的表達(dá)；選用tolls樣受體特異性激動(dòng)劑LPS和阻斷劑TAK-242刺激乳腺癌細(xì)胞后檢測(cè)兩株乳腺癌細(xì)胞PD-L1、STAT3轉(zhuǎn)錄因子、STAT3的表達(dá)情況；構(gòu)建靶向STAT3的siRNA和STAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞后檢測(cè)PD-L1的表達(dá)情況。結(jié)果 用LPS激活TLRs后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株的PD-L1表達(dá)分別升高1.5倍和2.4倍；用TAK-242抑制TLR后，MCF-7細(xì)胞中PD-L1表達(dá)下調(diào)1.7倍，而MDA-MB-231的PD-L1的表達(dá)量無顯著變化；用LPS激活TLRs后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株的STAT-3表達(dá)分別升高1.5倍和2.4倍；用TAK-242抑制TLR后，MCF-7細(xì)胞中STAT-3表達(dá)下調(diào)1.7倍，而MDA-MB-231的STAT-3的表達(dá)量無顯著變化。結(jié)論 本研究證明TLRs通過STAT3信號(hào)通路對(duì)PD-L1進(jìn)行調(diào)控，為聯(lián)合干預(yù)TLRS和PD-L1抑制腫瘤免疫逃避，提高乳腺癌治愈率據(jù)。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；免疫逃避；TLRs；PD-L1；STAT3

【中圖分類號(hào)】R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2018.06.17..02

免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有監(jiān)視和殺傷作用，而腫瘤則可通過多種免疫逃逸機(jī)制抵抗或逃避免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和清除，三陰性乳腺癌和孕激素/雌激素受體陽性乳腺癌是否通過調(diào)控程序性死亡受體1配體（PD-L1）介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃避不清楚[1-2]，本研究將通過探索TLRs信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，研究PD-L1和TLRs的調(diào)控關(guān)系，提高乳腺癌治愈率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自諾辰生物公司；胎牛血清購(gòu)自澳大利亞clark公司；L15和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自gibco公司；TAK-242 TLR4抑制劑購(gòu)自APEXBIO公司；LPS、TLR4樣受體激活劑購(gòu)自碧云天公司；抗PD-L1，STAT3兔源多克隆抗體購(gòu)自成都正能生物技術(shù)公司；抗PD-L1鼠源單克隆抗體購(gòu)自sigama公司；STAT3 siRNA干擾質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因公司合成。

1.2 Western Blotting

細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁，預(yù)冷PBS沖洗，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解，離心，取上清，加入buffer，電泳；半干式轉(zhuǎn)膜，脫脂乳封閉，孵育過夜，二抗孵育，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將兩株細(xì)胞分別接種于六孔板中，分為無任何處理組、STAT3過表達(dá)組、siRNA-STAT3組、無義siRNA組、空載體質(zhì)粒組，脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后制作檢測(cè)樣品，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western blotting均重復(fù)三次，隨后的各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，計(jì)算各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)誤。計(jì)量資料兩組比較用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、兩樣本t檢驗(yàn)和多樣本的LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TLRs促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)

MDA-MB-231細(xì)胞PD-L1的表達(dá)量高于MCF-71.9倍（P<0.01），用LPS激活TLRs時(shí)，MCF-7細(xì)胞膜上PD-L1表達(dá)量上調(diào)1.5倍（P<0.01），MDA-MB-231細(xì)胞膜上PD-L1表達(dá)量上調(diào)2.4倍（P<0.01）；用TAK-242抑制TLRs時(shí)，MCF-7細(xì)胞膜上PD-L1表達(dá)水平則下調(diào)1.7倍（P<0.05），MDA-MB-231細(xì)胞無顯著變化。

2.2 STAT3是TLRs的下游轉(zhuǎn)錄因子

MDA-MB-231中STAT3的表達(dá)量高于MCF-72.2倍（P<0.01）；用LPS處理MCF-7細(xì)胞中STAT3表達(dá)水平3.1倍（P<0.001），提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞中STAT3表達(dá)水平1.9倍（P<0.01）；而TAK-242處理則下調(diào)了MCF-7細(xì)胞中STAT3表達(dá)水平1.6倍（P<0.01），MDA-MB-231細(xì)胞變化不顯著。

2.3 TLRs通過STAT3信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)

在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中采用STAT3 siRNA敲減STAT3表達(dá)及用STAT3質(zhì)粒升高STAT3表達(dá)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減STAT3可減少M(fèi)CF-7細(xì)胞STAT3表達(dá)4.4倍（P<0.01），STAT3質(zhì)粒升高則1.9倍（P<0.05）；敲減STAT3減少M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞STAT3表達(dá)2.8倍（P<0.001），敲減STAT3可分別減少M(fèi)CF-7和MDA-MB-231細(xì)胞膜上PD-L1表達(dá)水平2.2倍和4.2倍（P<0.001）；反之高表達(dá)STAT3則分別提高5.2倍和3.8倍（P<0.001）。

3 討 論

免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有監(jiān)視和殺傷作用，而腫瘤則可通過多種免疫逃逸機(jī)制抵抗或逃避免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和清除[3-4]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，用LPS刺激后PD-L1的表達(dá)均上調(diào)，PD-L1的表達(dá)增加與降低是隨著STAT3的表達(dá)變化而變化的，證實(shí)STAT3是PD-L1的轉(zhuǎn)錄因子；TLRs信號(hào)通路可以通過STAT3上調(diào)PD-L1的表達(dá)來介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，本研究結(jié)果證明三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的PD-L1蛋白的表達(dá)量要高于孕激素/雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞株，證明PD-L1與TLRs信號(hào)通路的密切關(guān)系。本研究首次在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了TLRs通過STAT3信號(hào)通路對(duì)PD-L1的表達(dá)調(diào)控作用，為聯(lián)合干預(yù)TLRS和PD-L1抑制腫瘤免疫逃避，提高乳腺癌治療效果提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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本文編輯：吳 衛(wèi)