楊學(xué)山，楊孝樸，吳 兵，楊志杰

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

金屬離子對(duì)羊血超氧化物歧化酶活性的影響

楊學(xué)山，楊孝樸，吳 兵，楊志杰

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以離子交換層析法制備的羊血SOD（Superoxide dismutase）為原料，加入不同濃度的Na+、K+、Ba2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等金屬離子，25℃保溫4h后，利用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活力，并計(jì)算相對(duì)酶活力。結(jié)果表明：不同金屬離子在不同濃度下對(duì)羊血SOD酶活的影響不同。Na+對(duì)SOD酶活影響不大；K+、Ca2+、Fe2+在體外對(duì)羊血SOD具有激活作用，且Fe2+作用明顯，相對(duì)酶活力可達(dá)378.98%；Ba2+、Mg2+在低濃度下對(duì)SOD影響不大，在高濃度下有一定的激活作用，但不同濃度激活效果不同；Zn2+、Cu2+在體外對(duì)羊血SOD表現(xiàn)有抑制作用，但二者的抑制程度不同。

超氧化物歧化酶，金屬離子，酶活力

1969年Mccord和Fridovich根據(jù)血銅蛋白、肝銅蛋白和腦銅蛋白皆有超氧負(fù)離子歧化活性，而將其命名為超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD EC1，15，1，1）［1］。SOD的作用底物是機(jī)體產(chǎn)生的超氧陰離子（Superoxideanions，O-2·），它可使超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成過氧化氫和分子氧，從而促使超氧自由基分解，消除對(duì)機(jī)體的損害。所以SOD在一定程度上具有防止腫瘤發(fā)生、抗衰老、提高機(jī)體免疫力的作用，被用于某些急性炎癥、自身免疫性疾病、營養(yǎng)缺乏、腫瘤等的輔助治療［2］；SOD還可作為罐頭食品、果汁、啤酒等的抗氧化劑，防止過氧化酶引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象；另外，還可將SOD作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑加入食品中制成新的保健食品［3］?？茖W(xué)界預(yù)言，SOD將是全人類健康長(zhǎng)壽的最新型酶制劑，會(huì)被廣泛用于食品、醫(yī)療、化妝品等領(lǐng)域。SOD是一種金屬酶，金屬離子對(duì)維持酶的分子結(jié)構(gòu)及催化活性有重要作用，不同金屬離子對(duì)酶活性的影響不同［4］。研究金屬離子與酶活性的關(guān)系，有利于選擇合適的金屬離子作為佐劑或添加劑，提高SOD酶在醫(yī)藥衛(wèi)生和食品方面的利用價(jià)值。本研究以羊血為原料，利用離子交換層析法分離純化SOD，并研究了不同金屬離子在體外對(duì)羊血SOD活性的影響，以期為羊血中SOD的進(jìn)一步開發(fā)利用和提高產(chǎn)品品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮羊血 采自蘭州小西湖屠宰場(chǎng)；乙醇、氯仿、丙酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、焦性沒食子酸（鄰苯三酚）、氯化鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鋇、硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鈣等試劑均為分析純；牛血清白蛋白 購自上海試劑廠；DEAE-Sephadex A-50 購自pharmacia公司。

SL-1001電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-166臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-828 pH計(jì) 成都全速科技有限公司；808型紫外與可見分光光度計(jì) 日立公司；BJQ-74-2型部分收集器，移液槍，真空泵，透析袋，磁力攪拌器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊血SOD分離純化工藝流程 羊血預(yù)處理→收集紅血球→制備粗酶液→丙酮沉淀→熱變性→透析→層析→活性測(cè)定→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 羊血預(yù)處理 將收集的新鮮羊血去除毛等雜質(zhì)，加入10.0g/L檸檬酸三鈉抗凝。

1.2.2.2 收集紅血球 取新鮮羊血，以5000r/min離心15min，收集紅血球沉淀；將紅血球加0.9%NaCl溶液，5000r/min離心10min，重復(fù)3次，得潔凈紅血球。

1.2.2.3 制備粗酶液 取潔凈紅血球100mL，加等量去離子水?dāng)嚢枞苎?℃放置12h。按溶血體積的0.25倍緩慢加入預(yù)冷至4℃的無水乙醇和氯仿，攪拌15min，靜置2h。離心除去血紅蛋白，上清即為粗酶液。

1.2.2.4 丙酮沉淀 將粗酶液加1.5倍體積的冷丙酮，靜置20min。5000r/min離心15min，收集沉淀物。

1.2.2.5 熱變性處理 將沉淀物加適量去離子水溶解，置60℃熱處理15min，5000r/min離心15min，除去熱變性蛋白，收集上清液。

1.2.2.6 透析 將上清液置于透析袋中，在磷酸鉀鹽緩沖液中動(dòng)態(tài)透析6～8h。

1.2.2.7 DEAE-Sephadex A-50柱層析 將透析液小心加到已用磷酸鹽緩沖液平衡好的DEAE-Sephadex A-50柱，以流速0.5mL/min進(jìn)行梯度洗脫。

1.2.2.8 活性測(cè)定 收集具有蛋白吸收峰部分的洗脫液，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度［5］；以鄰苯三酚自氧化法測(cè)酶活力［6-7］。將比活力為6871U/mg的羊血 SOD提取液冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同金屬離子處理SOD 在酶活力最佳溫度及底物濃度條件下，向2.0mL酶液中分別加入0.5mL的NaCl、K2SO4、BaCl2·2H2O、CaCl2、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和FeSO4·7H2O，各金屬離子濃度梯度分別為1×10-5、3×10-5、5×10-5、1×10-4、3×10-4、5×10-4、1×10-3mol/L，25℃保溫4h。以上操作平行處理5次。

1.2.4 不同金屬離子處理后SOD活力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性［6-7］，并以無金屬離子反應(yīng)系統(tǒng)為對(duì)照，計(jì)算各種金屬離子存在下的相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 Na+、K+對(duì)SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測(cè)定的SOD酶活力換算成相對(duì)酶活力（以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100計(jì)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

在酶液中加入不同濃度的氯化鈉后，SOD酶活力隨濃度的增加有輕微變化，當(dāng) Na+濃度為0.5mmol/L時(shí)，酶活力為對(duì)照的92.68%。其他濃度下酶活力有略微增加，但不明顯，說明Na+對(duì)羊血SOD酶活力影響不大。

在酶液中加入K+后，SOD酶活力上升，其中加入K+濃度達(dá)到0.03mmol/L時(shí)，酶活力為最大，相對(duì)酶活力為140.67%，酶活力提高近1.5倍。K+濃度在0.05～1mmol/L之間時(shí)，酶活力變化不大，相對(duì)酶活力保持在120%左右，說明K+對(duì)羊血SOD有一定激活作用。

圖1 Na+、K+對(duì)SOD活力的影響

2.2 Ba2+、Ca2+對(duì)SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測(cè)定SOD酶活換算成相對(duì)酶活力（以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100計(jì)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 Ba2+、Ca2+對(duì)SOD活力的影響

在酶液中加入低濃度的Ba2+后，對(duì)SOD有抑制作用，當(dāng)加入的Ba2+濃度為0.03mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為101.01%，超過0.03mmol/L時(shí)，酶活力開始上升，在0.3mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為111.11%，并逐漸呈增加的趨勢(shì)，說明高濃度的Ba2+對(duì)羊血SOD有激活作用。

在酶液中加入不同濃度的Ca2+后，SOD酶活力總體略有上升，當(dāng)加入的 Ca2+濃度為0.03mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為140.67%，酶活力達(dá)到最大值；當(dāng)加入的 Ca2+濃度為 0.1mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為110.37%，酶活力為最小值，但相對(duì)酶活力仍大于100%，說明Ca2+對(duì)羊血SOD有激活作用。

2.3 Mg2+、Zn2+對(duì)SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測(cè)定的SOD酶活力換算成相對(duì)酶活力（以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100計(jì)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 Mg2+、Zn2+對(duì)SOD活力的影響

在酶液中加入不同濃度的Mg2+后，當(dāng)Mg2+濃度在0.01～0.05mmol/L低濃度范圍內(nèi)時(shí)，相對(duì)酶活力基本保持在100%，酶活力變化不大，而當(dāng)Mg2+濃度在0.05～0.5mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸增加，當(dāng)加入的Mg2+濃度為0.5mmol/L時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，相對(duì)酶活力為 146.76%，但當(dāng) Mg2+濃度大于0.5mmol/L時(shí)，酶活力下降。說明適宜濃度的Mg2+對(duì)羊血SOD具有激活作用。

在酶液中加入不同濃度的Zn2+后，SOD酶活力都有下降，當(dāng)加入的Zn2+濃度為0.3mmol/L時(shí)酶活力達(dá)到最小值，相對(duì)酶活力為64.49%，說明Zn2+對(duì)羊血SOD有抑制作用，且0.3mmol/L時(shí)抑制作用最明顯。

2.4 Cu2+、Fe2+對(duì)SOD活力的影響

將25℃保溫4h后測(cè)定SOD的酶活力換算成相對(duì)酶活力（以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100計(jì)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 Cu2+、Fe2+對(duì)SOD活力的影響

在酶液中加入不同濃度的Cu2+后，SOD酶活力下降，當(dāng)Cu2+濃度為0.01mmol/L時(shí)，酶活力達(dá)最小值，相對(duì)酶活力為49.78%，而當(dāng)Cu2+濃度為1mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為99.15%，基本不影響酶活力，說明不同濃度的Cu2+對(duì)羊血SOD的抑制作用不同，且濃度低的Cu2+對(duì)SOD抑制作用較大。

在酶液中加入不同濃度的Fe2+后，SOD酶活力明顯上升，當(dāng)Fe2+的濃度為0.01～0.05mmol/L時(shí)，酶活力最大，且基本保持穩(wěn)定，相對(duì)酶活力為378%左右，比對(duì)照酶活力提高3.8倍，隨著Fe2+濃度的增加，酶活力略有下降，當(dāng)Fe2+濃度為1mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為273.82%，說明Fe2+對(duì)羊血SOD有明顯的激活作用。

3 討論

酶要產(chǎn)生活性，必須有輔酶參與，已知許多金屬離子是酶或輔酶的組成成分［8］。不同的金屬離子對(duì)酶的影響有較大的差別，在有影響的金屬離子中，它們對(duì)酶的活力和功能所起的作用也不盡相同，同一種金屬離子對(duì)不同來源的特定酶也可能產(chǎn)生不同的效應(yīng)［9］。

本文研究了 Na+、K+、Ba2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+對(duì)羊血SOD的影響，發(fā)現(xiàn)Na+對(duì)羊血SOD影響輕微，可以認(rèn)為Na+對(duì)SOD活性幾乎無影響。K+、Ca2+、Fe2+對(duì)羊血SOD都有激活作用，使SOD酶活上升，但酶活性并非呈直線上升趨勢(shì)。K+、Ca2+濃度達(dá)到0.03mmol/L時(shí)，酶活力為最大，酶活力提高將近1.5倍，濃度在0.05～1mmol/L之間時(shí)，酶活力基本變化不大，相對(duì)酶活力保持在120%左右。Ba2+在低濃度時(shí)對(duì)SOD有抑制作用，當(dāng)濃度大于0.03mmol/L時(shí)，酶活力開始上升，對(duì)SOD有激活作用。隨著Fe2+濃度的增加，酶活力升高，相對(duì)酶活力總體呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，但當(dāng)Fe2+濃度為1mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活力為273.82%，活力仍很大，說明Fe2+對(duì)羊血SOD有明顯的激活作用。

分析這些離子對(duì)酶活影響的原因，一方面可能是金屬離子可直接與金屬酶SOD活性中心發(fā)生相互作用，并與酶活性中心的金屬離子發(fā)生誘導(dǎo)、置換作用等反應(yīng)，從而形成新的配位化合物，進(jìn)而影響酶活；另一方面，可能是因?yàn)榧尤脒^量的重金屬離子產(chǎn)生的毒害作用［10］。同時(shí)，加入的金屬離子可能與酶活性中心的金屬離子發(fā)生拮抗作用，從而激活或抑制酶活性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以離子交換層析法分離純化的羊血SOD為原料，研究了加入不同種類、不同濃度的常見金屬離子在體外對(duì)SOD活性的影響。結(jié)果證實(shí)，不同金屬離子在不同濃度下對(duì)羊血SOD酶活的影響不同。K+、Ca2+、Fe2+及高濃度的Ba2+、Mg2+對(duì)羊血SOD具有激活作用，且 Fe2+作用明顯，當(dāng)加入 0.01～0.05mmol/L的Fe2+時(shí)，相對(duì)酶活力最大，可將酶活力提高3.8倍；高濃度的Zn2+、Cu2+在體外對(duì)羊血SOD活性有抑制作用，當(dāng)加入0.3mmol/L Zn2+時(shí)，相對(duì)酶活力為44.49%，達(dá)到最小值。

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Effect of metal ions on activities of SOD extracted from sheep blood

YANG Xue-shan，YANG Xiao-pu，WU Bing，YANG Zhi-jie
（College of Life Scienceamp;Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The activities of SOD extracted by ion-exchange chromatography from sheep-blood enzyme solution were determined by means of pyrogallo autoxidation method under the different concentrations of Na+，K+，Ba2+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e2+at 25℃ for 4h.The results showed that different concentrations of metal ions had different influence on sheep blood SOD activity.Na+had little effect on SOD activity.K+，Ca2+and Fe2+had an activation on the activity of SOD in vitro，especially Fe2+could add the relative enzyme activity of SOD up to 378.98%.Ba2+，Mg2+had little effect on activity of SOD at low concentrations，whereas the activation was detected at high concentrations.Zn2+and Cu2+inhibited the activition of SOD in vitro.

superoxide dismutase；metal ions；enzyme activity

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0089-03

2010-01-07

楊學(xué)山（1977-），男，講師，研究方向：生物化學(xué)與生物制品。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2010-03）。