李君文，趙新淮

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.滕州市糧食局，山東滕州277500）

食品中的蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)

李君文1，2，趙新淮1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.滕州市糧食局，山東滕州277500）

綜述了食品中的美拉德反應(yīng)衍生的交聯(lián)、二硫鍵交聯(lián)反應(yīng)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)反應(yīng)、酪氨酸殘基引發(fā)的交聯(lián)反應(yīng)、脫氫蛋白質(zhì)交聯(lián)等五種蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)以及研究進(jìn)展，通過蛋白質(zhì)交聯(lián)可以提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和營養(yǎng)價值，從而擴(kuò)大了蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍。

蛋白質(zhì)，交聯(lián)技術(shù)，研究進(jìn)展

圖1 食品中蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)種類

1 美拉德反應(yīng)衍生的交聯(lián)

美拉德反應(yīng)主要是指食品中的還原糖與氨基酸、蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜反應(yīng)。1912年，法國人Louis-Camille Maillard發(fā)現(xiàn)了這個反應(yīng)，1953年Hodge等把這個反應(yīng)正式命名為Maillard（美拉德）反應(yīng)。

美拉德反應(yīng)過程中，蛋白質(zhì)交聯(lián)會形成一系列的產(chǎn)物，在食品加工中由美拉德反應(yīng)引起的交聯(lián)蛋白研究得已經(jīng)很清楚，但是這些交聯(lián)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)還不是很清楚。Jinq等［3］研究了酪蛋白和單糖（果糖、葡萄糖和核酸糖）間的美拉德反應(yīng)，利用SDS-PAGE、MALDI-TOF質(zhì)譜等測定不同的單糖-酪蛋白美拉德產(chǎn)物的熒光、紫外和酪蛋白分子質(zhì)量的變化，得出3d后核酸糖-酪蛋白美拉德產(chǎn)物呈現(xiàn)出顯著的熒光特性，而15d后葡萄糖、果糖-酪蛋白美拉德產(chǎn)物的紫外特性較為顯著，同時質(zhì)譜結(jié)果表明，酪蛋白和單糖間的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了許多大分子量物質(zhì)。Rufia′n-Henares等［4］利用糠氨酸對以牛奶為基料的運動營養(yǎng)補(bǔ)品進(jìn)行質(zhì)量評價，糠氨酸是賴氨酸美拉德反應(yīng)的最適底物，常用于運動營養(yǎng)補(bǔ)品中一些成分的評價，結(jié)果表明，于干燥的運動營養(yǎng)補(bǔ)品中添加79mg糠氨酸/100g蛋白可以控制以牛奶為基料的產(chǎn)品的質(zhì)量，過高的添加水平則會導(dǎo)致質(zhì)量下降，不適宜保藏。Jimenez等［5］研究了β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白和葡聚糖間的美拉德反應(yīng)，結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的聚合物在低pH下溶解度有所增加，主要是多糖和蛋白質(zhì)間的共價交聯(lián)降低了蛋白質(zhì)的等電點；在酸性條件下，乳清蛋白中不耐熱的牛血清白蛋白和β-乳球蛋白熱穩(wěn)定性均有提高。因此通過控制乳清蛋白與葡聚糖間美拉德反應(yīng)可以擴(kuò)大其在食品加工中的應(yīng)用范圍，主要是其酸性條件下具有較好的熱穩(wěn)定性和乳化性能。

在碳水化合物含量較低的食品中，美拉德反應(yīng)受到限制，而食品加工中劇烈的熱處理過程，可使賴氨酸的ε-氨基與精氨酸或是谷氨酰胺殘基縮合形成異肽鍵，使得蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，然而這類交聯(lián)還未被廣泛的研究。

2 二硫鍵交聯(lián)反應(yīng)

二硫鍵交聯(lián)是在食品蛋白質(zhì)交聯(lián)中最為普遍和最具有特征性的共價交聯(lián)，二硫鍵的形成主要是通過合適的氧化劑氧化食品蛋白質(zhì)基質(zhì)中相鄰的兩個半胱氨酸殘基，從而產(chǎn)生了二硫鍵交聯(lián)，其交聯(lián)機(jī)理如圖2所示。

圖2 二硫鍵交聯(lián)反應(yīng)機(jī)制

在一些食品蛋白質(zhì)（如乳蛋白、大豆蛋白、雞蛋蛋白、肉蛋白和蔬菜蛋白）的熱致凝膠形成過程中，蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵交聯(lián)對其凝膠性有著顯著的影響。蛋白質(zhì)分子共價交聯(lián)形成的凝膠主要是生成了三維的類固體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而賦予了食品更好的質(zhì)地。Singh等［6］研究了熱處理對牛奶的影響，通過形成二硫鍵，增強(qiáng)變性β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之間的相互作用，從而增加牛奶及牛奶制品的穩(wěn)定性，阻止β-乳球蛋白的沉淀。二硫鍵交聯(lián)形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還可以提高生面團(tuán)的粘彈性和結(jié)構(gòu)特性，使面包呈現(xiàn)出更好的特性。Martin等［7］研究了葡萄糖氧化酶氧化生面團(tuán)中的麥谷蛋白，結(jié)果表明，在過氧化氫存在的條件下，葡萄糖氧化酶催化麥谷蛋白中的游離巰基形成二硫鍵，改變了小麥生面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)。Bonet等［8］將葡萄糖氧化酶對生面團(tuán)以及其焙烤產(chǎn)品的影響作了進(jìn)一步的研究。通過添加葡萄糖氧化酶可以改善小麥面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)和面包的質(zhì)量。利用毛細(xì)管電泳和電子掃描電鏡分別從分子、超分子水平上觀察樣品中的谷蛋白，結(jié)果顯示處理后樣品中的谷蛋白（麥醇溶蛋白和麥谷蛋白）有二硫鍵形成，還有一些非二硫鍵形成。

3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)反應(yīng)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，EC 2.3.2.13，簡稱TG），是一種催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間形成ε-（γ-谷氨?；┵嚢彼峁矁r鍵的酶，通過催化反應(yīng)，可引起各種蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)、分子間的交聯(lián)以及蛋白質(zhì)與氨基酸之間的連接，形成高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。主要是利用肽鏈上的谷氨酰胺殘基的γ-甲酰胺基作為?；w，而酰基受體可以是［9］（Folk，1980）：

a.多肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基，形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的ε-（γ-谷氨?；┵嚢彼岙愲逆I（圖3a），通過該反應(yīng)蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，使食品及其它制品產(chǎn)生質(zhì)構(gòu)變化，從而賦予產(chǎn)品特有質(zhì)構(gòu)特性和黏合性質(zhì)。

要讓文物的歷史文化價值得到充分體現(xiàn)，作用得到充分的發(fā)揮，首當(dāng)其沖的工作就是讓文物“活起來”。實現(xiàn)這個目標(biāo)，我們必須有效發(fā)掘出文物中隱藏的歷史、藝術(shù)和科學(xué)等人文信息，同時通過科學(xué)、通俗、多元化的手段傳遞給廣大的民眾。實現(xiàn)這一點并不困難，這需要我們對文物進(jìn)行由內(nèi)而外的多層次探究，以及相關(guān)的文獻(xiàn)和歷史事實加以證明，將挖掘到的文物的價值和內(nèi)涵使其有效地外化和具體化，并利用民眾易于接受的方式，以及借助現(xiàn)代科技的手段，把歷史的知識和內(nèi)涵告訴民眾，向所有的人闡述文物深層次下的故事。

b.伯胺基，形成蛋白質(zhì)分子和小分子伯胺之間的連接（圖3b），從而可將一些限制性氨基酸引入蛋白質(zhì)中，以提高其營養(yǎng)價值。

c.當(dāng)不存在伯胺時，水會成為?；荏w，結(jié)果是谷氨酰胺殘基脫去氨基生成谷氨酸殘基（圖3c）。該反應(yīng)可用于改變蛋白質(zhì)的等電點及溶解度。

圖3 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的催化反應(yīng)機(jī)理

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶早已廣泛地應(yīng)用于催化食品蛋白質(zhì)交聯(lián)，改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。李紅［10］利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶生產(chǎn)大豆蛋白食用保鮮膜，研究了添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對大豆蛋白成膜特性的影響，結(jié)果表明，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)的大豆蛋白食用保鮮膜，有較好的水蒸氣阻隔性能和隔油性，能達(dá)到食品保鮮的要求。劉心偉［11］利用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的乳蛋白質(zhì)，乳蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚合作用，且這些聚合物不易發(fā)生聚集，從而提高乳化性。αs1-酪蛋白、γ-酪蛋白等經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后發(fā)生交聯(lián)，可以作為優(yōu)良的乳化劑應(yīng)用于乳品生產(chǎn)中。Farnsworth等［12］以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對山羊乳酪進(jìn)行改性，結(jié)果表明添加了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的山羊乳酪的黏度有所改善，優(yōu)于添加總固形物的方法；通過掃描電子顯微鏡觀察處理前后的樣品，處理后樣品的微觀結(jié)構(gòu)更為緊密，說明添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以提高乳酪凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。Hinz等［13］以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對全脂乳和脫脂乳進(jìn)行改性，對乳中脂肪球的穩(wěn)定性和乳蛋白的乳化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，酶處理對乳蛋白的乳化性質(zhì)有很大影響，乳中脂肪球的穩(wěn)定性得到提高。Huppertz等［14］將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化交聯(lián)酪蛋白膠束，通過共價鍵連接形成酪蛋白網(wǎng)絡(luò)得到納米膠微粒，與熱致凝膠相比，所形成的納米膠微粒的穩(wěn)定性有所提高。

4 酪氨酸殘基引發(fā)的交聯(lián)反應(yīng)

天然蛋白質(zhì)或糖蛋白中的酪氨酸殘基交聯(lián)已經(jīng)被證實，Singh［15］研究了植物細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)交聯(lián)。研究表明催化酪氨酸殘基交聯(lián)的酶主要有多酚氧化酶、過氧化氫、過氧化物酶等。

4.1 多酚氧化酶

多酚氧化酶是指催化酚類底物氧化的一組酶，屬于氧化還原酶類。能作用于羥基處在鄰位的二酚和三酚類化合物，生成相應(yīng)的醌，它也能作用于單酚，將其轉(zhuǎn)變成鄰二酚。這種酶根據(jù)所作用底物的不同有許多習(xí)慣名稱，如酪氨酸酶、甲酚酶、多酚氧化酶、兒茶酚酶、鄰二酚氧化酶、酚酶等。

在大多數(shù)水果中，多酚氧化酶主要以結(jié)合狀態(tài)存在，例如桃、甜櫻桃、杏子和蘋果。從食品原料分離出的多酚氧化酶是一種每個亞基均含有銅的寡聚體。銅以Cu+-Cu2+離子對形式緊密結(jié)合在一起，并在酶的活性部位形成二硫-銅的結(jié)合物。圖4給出了酪氨酸酶的催化反應(yīng)機(jī)制。

圖4 多酚氧化酶催化反應(yīng)機(jī)制

酪氨酸酶催化循環(huán)包括三種形式的酶：脫氧-酪氨酸（Ed，Cu+Cu+）、氧合酪氨酸酶（Eox，Cu2+-O2-Cu2+）和金屬酪氨酸酶（Em，Cu2+Cu2+）。以催化單酚和二酚為例，Ed結(jié)合氧氣轉(zhuǎn)化為Eox。Eox催化單酚（如酪氨酸）生成二酚，然后氧化成醌，同時Eox轉(zhuǎn)化成Ed或通過中間產(chǎn)物生成Em；Eox也可以催化二元酚（如多巴）生成相應(yīng)的醌。Em氧化二酚生成醌，自身轉(zhuǎn)化為Ed，Em可與單酚結(jié)合產(chǎn)生化合物EmM，該化合物不能與氧結(jié)合。同時醌轉(zhuǎn)化為二羥基吲哚啉（如多巴醌轉(zhuǎn)化為環(huán)多巴），催化循環(huán)結(jié)束。

酪氨酸酶可使食品中的酪氨酸殘基和酚類化合物氧化為醌，也能與半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸和色氨酸殘基反應(yīng)，從而減少了必需氨基酸含量［16］。Jee等［17］以酪氨酸酶催化含有酪氨酸的多肽，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行器質(zhì)譜分析得知，酪氨酸酶催化的多肽交聯(lián)反應(yīng)是直接氧化交聯(lián)酪氨酸殘基上的苯環(huán)，從而生成黑色素。Selinheimo等［18］利用漆酶和酪氨酸酶分別催化蛋白質(zhì)和糖、α-酪蛋白和酚酸之間的交聯(lián)，通過SDS-PAGE、體積排阻色譜、熒光分析等進(jìn)行分析，結(jié)果表明，這兩種酶均可催化蛋白質(zhì)和糖、蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)之間的交聯(lián)反應(yīng)，只是這兩種酶的催化效率有較大的差別。

4.2 過氧化物酶

過氧化物酶系統(tǒng)名為供體：過氧化氫-氧化還原酶，是指在有供氫體參與下，催化過氧化氫分解的酶（EC 1.11.1）。當(dāng)以過氧化氫為供氫體時，該酶稱為過氧化氫酶（EC 1.11.1.6）。

圖5 過氧化物酶催化反應(yīng)

過氧化氫酶廣泛地分布于自然界中，在植物細(xì)胞中以可溶和結(jié)合兩種形式存在，可溶形式存在于細(xì)胞漿中，結(jié)合形式是與細(xì)胞壁或細(xì)胞器相結(jié)合而存在。在大多數(shù)的水果和蔬菜中過氧化物酶以可溶態(tài)、離子結(jié)合態(tài)和共價結(jié)合態(tài)存在?？芍苯訌闹参锊牧现刑崛∵^氧化物酶。此外，也可以先制備丙酮粉，然后再從丙酮粉提取。辣根是過氧化物酶最重要的一個來源。

辣根過氧化物酶（Horesradish peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7）是廣泛存在于辣根體內(nèi)的過氧化物酶。HRP是以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白。在過氧化氫存在時，它能夠催化一系列底物發(fā)生反應(yīng)。辣根中的過氧化物酶由眾多的同工酶組成，40種以上的辣根過氧化物酶的同工酶在辣根植物中被發(fā)現(xiàn)，它們具有類似的相對分子質(zhì)量（40000～45000）。這種酶是糖蛋白，每一個酶分子中含有一個正鐵血紅素Ⅲ、一條酶蛋白多肽鏈和兩個Ca2+，酶蛋白含有308個氨基酸殘基，3～8個糖類側(cè)基鏈與丙氨酸殘基相連，糖含量可達(dá)18%。辣根過氧化物酶分子中含10個突出的螺旋段。辣根過氧化物酶催化反應(yīng)的機(jī)制如圖6所示［19］。

圖6 辣根過氧化物酶催化反應(yīng)機(jī)制

在辣根過氧化物酶催化的反應(yīng)中，過氧化氫首先取代了與過氧化物酶分子（E）中血紅素相結(jié)合的H2O，形成酶-底物絡(luò)合物（Ei），Ei和外源氫供體底物作用生成化合物Eii，并形成自由基（RO·）?；衔顴ii和第二個氫供體底物分子作用后，過氧化物酶分子E再生，同時生成第二個自由基。這些自由基可以進(jìn)一步聚合生成新的化合物。

Tenovuo等［20］將乳過氧化物酶分別作用于人體牙周膜膠原、牛跟骨腱膠原、胃蛋白酶、胰島素和α-淀粉酶，利用紫外和熒光分析可知，胃蛋白酶的交聯(lián)程度最高，在牙周膜膠原中也有交聯(lián)產(chǎn)生，而在α-淀粉酶沒有交聯(lián)反應(yīng)。Steffensen等［21］將灰蓋鬼傘過氧化物酶作用于多肽，利用電子自旋共振研究得出灰蓋鬼傘過氧化物酶催化反應(yīng)首先定位于芳香環(huán)的碳1位置，通過消去兩個氫原子形成二酪氨酸鍵或是異二酪氨酸鍵得到酪氨酸自由基中間產(chǎn)物，最后形成酪氨酸多肽的聚合物。此聚合反應(yīng)表明灰蓋鬼傘過氧化物酶可以修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。

4.3 酚類化合物

酚類化合物是一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦吞烊坏鞍踪|(zhì)交聯(lián)劑。阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、單寧酸等酚酸類化合物，能與蛋白質(zhì)中的賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等反應(yīng)而使蛋白質(zhì)交聯(lián)。其交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理如圖7所示：二元酚酸或者其它的多元酚（1）經(jīng)分子氧或酶作用氧化成醌。醌發(fā)生側(cè)鏈反應(yīng)生成二聚體（2），或者與多肽側(cè)鏈氨基或巰基反應(yīng)形成酚環(huán)上的C-N或C-S共價鍵，并再次形成酚羥基結(jié)構(gòu)。后者可以再次被氧化并結(jié)合第二個多肽，從而形成交聯(lián)化合物（3）。另外，具有一個側(cè)鏈的兩個醌之間也可以聚合形成交聯(lián)化合物（4）［22］。

圖7 酚酸與多肽氨基側(cè)鏈的反應(yīng)

多酚化合物作為蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，最早應(yīng)用于制革工業(yè)的皮革鞣制，而在食品中的應(yīng)用，近幾年才有報道。歐仕益等［23］在制備大豆分離蛋白可食性膜時，通過添加單寧、阿魏酸和玉米淀粉等交聯(lián)劑，提高了蛋白膜的機(jī)械特性以及膜蛋白的消化率。Strauss等人［22］用純酚酸和含有酚酸的咖啡、葡萄汁等交聯(lián)明膠制備凝膠和明膠-果膠復(fù)聚微球。研究結(jié)果表明，制備的凝膠具有較強(qiáng)的機(jī)械特性，含有較少的游離氨基團(tuán)。DSC結(jié)果顯示，交聯(lián)凝膠形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻止了pH偏離等電點時的肽鏈伸展；與未交聯(lián)聚微球相比，交聯(lián)形成的明膠-果膠聚微球脂溶性較強(qiáng)，200℃時穩(wěn)定。這些性質(zhì)使得交聯(lián)明膠凝膠和交聯(lián)明膠-果膠聚微球作為新型食品添加劑運用于食品加工中。

5 脫氫蛋白質(zhì)交聯(lián)

在食品加工中，堿處理常常被用來去除食品中的有毒成分，或是使蛋白質(zhì)增溶制備組織化產(chǎn)品，同時堿處理引發(fā)的反應(yīng)會給食品帶來一些不需要的性質(zhì)，而且其食品安全性也有爭議。在堿性條件下，熱處理可使氨基酸殘基發(fā)生消旋作用，形成共價交聯(lián)，如脫氫丙氨酸、賴氨酸丙氨酸和羊毛硫氨酸［24］。脫氫丙氨酸主要是通過催化消除二硫鍵中的過硫化物；賴氨酸丙氨酸和羊毛硫氨酸是通過半胱氨酸和磷酸化絲氨酸蛋白質(zhì)殘基的β-消除作用發(fā)生交聯(lián)，形成脫氫蛋白質(zhì)。脫氫蛋白質(zhì)易與許多親核基團(tuán)（如賴氨酸殘基上的ε-氨基、半胱氨酸的巰基）發(fā)生反應(yīng)，劇烈的熱處理或是堿處理，還可以與咪唑、吲哚、胍基以及其他的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，形成了分子間或是分子內(nèi)的交聯(lián)，而且這種交聯(lián)結(jié)構(gòu)是比較穩(wěn)定的。

6 展望

食品中的各交聯(lián)反應(yīng)在其適宜的條件下，均能引起蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與其它基質(zhì)的交聯(lián)，并能較顯著地改善食品的功能性質(zhì)。然而，由于食品中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的限制，僅一些活性較大的分子參與反應(yīng)，若要產(chǎn)生數(shù)量較多的交聯(lián)產(chǎn)物，還有更多的工作需要去做，這可能是一個漫長的過程，需要多種技術(shù)手段作保證。但是我們?nèi)钥深A(yù)見蛋白質(zhì)交聯(lián)的應(yīng)用前景是非常廣闊的。

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Research progress in protein cross-linking in food

LI Jun-wen1，2，ZHAO Xin-huai2
（1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Grain Administration of Tengzhou，Tengzhou 277500，China）

The protein crosslinking，including crosslinks derived from the Maillard reaction，disulfide crosslinks，crosslinks formed via transglutaminase catalysis，crosslinks derived from tyrosine and crosslinks derived from dehydroprotein were studied.lmproving proteins functionality properties and nutrition can be accomplished by means of cross-linking，while can expend their food application.

protein；cross-linking；research progress

TS201.2+1

A

1002-0306（2011）01-0380-05

2009-12-15

李君文（1984-），女，碩士研究生，講師。