陳紅惠，彭光華

（1.文山學(xué)院生化系，云南文山663000；2.西藏自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，西藏拉薩540000）

雪蓮果葉酚酸抗氧化能力的研究

陳紅惠1，彭光華2

（1.文山學(xué)院生化系，云南文山663000；2.西藏自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，西藏拉薩540000）

通過測定雪蓮果葉酚酸提取物的還原能力和對化學(xué)模擬體系中羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O-2·）及二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）的清除能力，研究了雪蓮果葉酚酸提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：雪蓮果葉酚酸提取物具有較強的抗氧化能力，對自由基有明顯清除作用，并且隨著雪蓮果葉酚酸濃度的增加，其抗氧化能力有顯著增強的趨勢。

雪蓮果葉，酚酸提取物，抗氧化作用，清除自由基

雪蓮果（Smallanthus sonchifolius，英文名yacon）為菊科向日葵屬雙子葉草本植物［1］，含有較高的低聚果糖和多種活性成分，可預(yù)防肥胖、便秘及腸道疾病，降低血脂和膽固醇，具有提高人體免疫功能，降火清毒等功效［2-3］。雪蓮果現(xiàn)已成為國際上針對糖尿病人保健品及藥品的珍貴原料，在很多國家的糖尿病協(xié)會內(nèi)部被推薦使用［4-5］。由于雪蓮果特殊的保健功能及藥用價值，雪蓮果在日本以及一些歐洲國家被廣泛引種。各國對雪蓮果及葉子的成分展開了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)雪蓮果葉提取物具有較高的抗氧化活性，還可以清除體內(nèi)自由基，緩解肝細胞氧化損傷等，主要是與其中的酚酸成分有關(guān)，包括綠原酸、咖啡酸和阿魏酸等［6-7］。目前對于雪蓮果葉的研究已經(jīng)成為熱點，而國內(nèi)對雪蓮果及莖葉的研究還較少，特別是對于具有生物活性成分酚酸類物質(zhì)的活性研究還沒有相關(guān)的報道。本文通過對雪蓮果葉酚酸提取物清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基能力的分析，對雪蓮果葉酚酸的體外抗氧化性能進行了研究，對雪蓮果資源的深加工和綜合利用具有一定的理論意義和應(yīng)用價值，為其開發(fā)利用和深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪蓮果葉 由云南陸良雪蓮果種植基地提供；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；2，2-二苯代苦味肼基自由基（DPPH） Sigma公司；95%乙醇、K3Fe（CN）6、FeCl3、甲苯、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、VC、水楊酸、雙氧水、硫酸亞鐵 均為國產(chǎn)分析純。

101-3型電熱恒溫干燥箱，722型可見分光光度計，8002型電子恒溫水浴鍋，EYELA N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 雪蓮果葉酚酸提取物的制備 稱取一定量的雪蓮果干葉粉碎過篩，置于磨口三頸燒瓶中，用一定體積的30%乙醇在70℃下水浴提取兩次，過濾合并濾液，在45℃下真空減壓濃縮，濃縮液加入適量無水乙醇，除去蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)后，經(jīng)X-5樹脂純化后得到雪蓮果葉酚酸提取物。

1.2.2 雪蓮果葉酚酸還原力的測定［8］將雪蓮果葉酚酸提取物配成不同濃度，吸取2.5mL，加入2.5mL磷酸緩沖溶液（pH 6.6，0.2mol/L）及 2.5mL 1% K3Fe（CN）6，置50℃恒溫水浴中反應(yīng)20min后迅速冷卻，再加入2.5mL10%的三氯醋酸，混合后離心，取上清液5mL，加入5mL去離子水，1.0mL 0.1%FeCl3溶液?；旌暇鶆颍?min后于700nm處測其吸光值，以去離子水作為空白。

1.2.3 雪蓮果葉酚酸清除羥自由基的測定［9-13］取8.8mmol/L H2O21mL，9mmol/L FeSO41mL，9mmol/L水楊酸-乙醇1mL，待測溶液1mL，定容至10mL，混勻后在37℃下水浴0.5h，其中以蒸餾水為參比，在510nm下測吸光值?？紤]待測溶液本身的吸光值不同，以9mmol/L FeSO41mL，9mmol/L水楊酸-乙醇1mL，不同濃度雪蓮果葉酚酸提取物1mL和蒸餾水1mL作為待測液本底吸收值，測定雪蓮果葉酚酸清除羥基自由基的能力。吸光值越小，待測物清除自由基能力越高。清除率計算公式為：

式中：A0-不加粗提物的空白對照吸光度；Ax-加入待測液后吸光度；Ax0-無顯色劑時粗提物本底吸光度。

1.2.4 雪蓮果葉酚酸清除超氧陰離子自由基的測定

取0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.2）5mL，在37℃水浴預(yù)熱10min，加入不同濃度的酚酸樣品1.0mL和25mmol/L的鄰苯三酚 0.5mL，混勻后于37℃水浴反應(yīng)4min，用1.0mL濃鹽酸終止反應(yīng)，于320nm下測定吸光值。以相同體積蒸餾水代替樣品作為空白對照組，每個試樣作三次平行實驗，取平均值。清除率計算公式為：

式中：A空白-空白組吸光度值；A對照-對照組吸光度值；A樣品-待測多糖液吸光度值。

1.2.5 雪蓮果葉酚酸清除DPPH自由基的測定 將DPPH溶于少量甲苯后，用60%乙醇配成0.1g/L的溶液。取2.0mL不同濃度的雪蓮果葉酚酸溶液加入2.0mL DPPH溶液中，迅速混勻，室溫下避光靜置20min，于517nm下測吸光度，以60%乙醇作為參比。

式中：As-2mL待測液與2mL DPPH反應(yīng)后的吸光度；Ar-樣品的對照（2.0mL待測液+2.0mL 60%的乙醇）的吸光度；Ao-未加樣的DPPH（2.0mL DPPH+ 2.0mL 50%乙醇）的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪蓮果葉酚酸還原力測定

一般情況下，樣品的還原能力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性，本文取不同濃度的雪蓮果葉粗提物，按照1.2.2的方法進行測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 雪蓮果葉酚酸的還原力

還原力的測定可檢驗樣品是否為良好的電子供應(yīng)者，還原力強的樣品應(yīng)為良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除了可使 Fe3+還原為 Fe2+外，也可參與自由基反應(yīng)，使自由基成為穩(wěn)定的物質(zhì)。由圖1可看出，雪蓮果葉酚酸具有一定的還原能力。還原能力隨著酚酸濃度增大而增加，即提取物的還原能力與其濃度呈線性關(guān)系。濃度低于0.1mg/mL時，雪蓮果葉酚酸還原能力維持在較低水平，吸光值低于0.2；當(dāng)濃度達0.5mg/mL時，還原能力明顯增加，吸光值達到0.482；濃度繼續(xù)增加，還原能力不斷增大，可見雪蓮果葉酚酸具有較強的還原能力。

2.2 雪蓮果葉酚酸對羥自由基的清除作用

取不同濃度的雪蓮果葉提取液，按1.2.3的方法進行測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酚酸提取物清除羥自由基的能力

由圖2可以看出，雪蓮果葉酚酸提取物對羥基自由基有良好的清除作用，并且隨著提取物濃度的增加，清除作用明顯增強。當(dāng)酚酸濃度達到2mg/mL時，清除率接近50%；濃度繼續(xù)增加，酚酸提取物的羥自由基清除率迅速提高，當(dāng)酚酸溶液濃度達到8mg/mL時，清除率可達78.23%，說明雪蓮果葉酚酸具有很好的清除羥基自由基活性。

2.3 雪蓮果葉酚酸對超氧陰離子自由基的清除作用

采用鄰苯三酚（即焦性沒食子酸）自氧化法，根據(jù)鄰苯三酚在堿性條件下自氧化形成中間產(chǎn)物O-2·，此自由基能促進鄰苯三酚的自動氧化，因此通過測定某物質(zhì)對鄰苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其對O-2·的清除作用。測定不同濃度雪蓮果葉酚酸對O-2·的清除作用，結(jié)果見圖3。

圖3顯示了雪蓮果葉酚酸對超氧陰離子自由基的清除能力，隨著酚酸濃度的提高，對O2-·的清除率呈正相關(guān)。由圖可知，酚酸濃度在1mg/mL時，清除率達到22.63%；當(dāng)酚酸濃度達到6mg/mL時，其對O2-·的清除率可達50%以上，說明雪蓮果葉酚酸對超氧陰離子自由基有良好的清除能力。

圖3 酚酸提取物清除超氧陰離子自由基的能力

2.4 雪蓮果葉酚酸對DPPH自由基的清除作用

分別取雪蓮果葉粗提物、VC、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成不同濃度的溶液，按照1.2.5的方法進行測定，所得結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 酚酸提取物對DPPH自由基的清除效果

圖5 綠原酸對DPPH自由基的清除效果

圖6 VC對DPPH自由基的清除效果

在各種體外抗氧化分析方法中，DPPH法具有快速、簡便、靈敏和直接可行的優(yōu)點，已被廣泛用于自由基清除劑的篩選工作中。DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的、以氮為中心的自由基，呈紫色，在517nm有強吸收。若受試物能清除它，則提示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。

由以上結(jié)果來看，雪蓮果葉酚酸提取物對DPPH自由基具有顯著的清除作用。其中雪蓮果葉酚酸提取物、綠原酸和VC三者對DPPH的清除率可得回歸方程：Y=-871.39x2+561.16x+1.0732（R2=0.9977），Y=-24015x2+3220.3x+8.9082（R2=0.9232），Y= -82734x2+9248.5x-2.6061（R2=0.9924）。由此得到，雪蓮果粗提物、綠原酸和VC的IC50（清除率為50% 時 試 樣 濃 度）分 別 為 0.104、0.01424、0.006011mg/mL。比較IC50可知，綠原酸的DPPH清除率略低于VC。在實驗濃度范圍內(nèi)，酚酸提取物的清除率隨其濃度的增大而升高，且清除率與濃度間存在一定的量效關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究通過鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法考察了雪蓮果葉酚酸清除氧自由基、羥基自由基的能力，采用分光光度法測定酚酸提取物對DPPH自由基的清除效果。雪蓮果葉酚酸抗氧化活性實驗表明，酚酸提取物表現(xiàn)為良好的電子供體，還原能力強，對羥基自由基、超氧陰離子和DPPH自由基有一定的清除作用，酚酸濃度對清除自由基的效果有一定的影響，在一定濃度范圍內(nèi)，酚酸提取物清除自由基的效果隨樣品濃度的增加，呈上升趨勢，存在一定的量效關(guān)系，為酚酸的藥用機理提供了新的思路，同時也為雪蓮果葉在保健食品或藥物中的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Study on antioxidant activity of phenolic acid in yacon leaves

CHEN Hong-hui1，PENG Guang-hua2
（1.Department of Bio-chemistry，Wenshan University，Wenshan 663000，China；2.Tibet Bureau of Quality and Technique Supervision，Lhasa 540000，China）

The antioxidation activity of phenolic acid in yacon leaves was discussed by measuring their reducing ability and the ability of scavenging hydroxyl radicals（·OH），superoxide anion radicals（O-2·）and 1，1-diphenyl -2-picryl-hydrazyl radicals（DPPH·）.The result indicated that the phenolic acid in yacon leaves had preferable antioxidation activity and the ability of scavenging free radicals，between effect of the scavenge radical and concentration of sample showed certain dose-effect relationships.

yacon leaves；phenolic acid；antioxidation activity；free radical scavenging

TS255.1

A

1002-0306（2011）01-0103-03

2010-01-12

陳紅惠（1979-），女，碩士研究生，主要從事食品的分析、開發(fā)方面的研究。

文山學(xué)院科研基金項目（09WSY05）。