雷 虹，張鐵丹，金忠斌，莊海霽，何 欣，張基亮，平文祥，周東坡

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080）

L.PARACASEI HD1-7與S.ALBULUS1-25原生質(zhì)體融合選育產(chǎn)天然防腐劑的優(yōu)良菌株

雷 虹，張鐵丹，金忠斌，莊海霽，何 欣，張基亮，平文祥*，周東坡*

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080）

為獲得更具優(yōu)良應(yīng)用特性的微生物源天然防腐劑，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，以Lactobacillus paracasei HD1-7和Streptomyces albulus 1-25為親株選育優(yōu)良菌株，研究了L.paracasei HD1-7和S.albulus 1-25原生質(zhì)體制備與再生條件，通過(guò)表型、抑菌譜、抗藥性和總DNA含量比較等手段篩選鑒定融合子，最終選育出3株以L.paracasei HD1-7為受體、獲得來(lái)自S.albulus1-25的抑酵母菌基因的融合子。

L.paracasei HD1-7，S.albulus1-25，天然防腐劑，原生質(zhì)體制備，融合子鑒定

在談防腐劑色變的年代，天然食品防腐劑由于安全無(wú)毒，甚至有的對(duì)人體有保健作用而受到人們的廣泛關(guān)注［1-3］。在各種天然源的食品防腐劑開(kāi)發(fā)過(guò)程中，人們把目光轉(zhuǎn)向微生物。通過(guò)微生物代謝生產(chǎn)天然防腐劑，由于周期短、基因改造易操作等優(yōu)勢(shì)而成為天然防腐劑研究的主流方向［4-5］，具有廣闊開(kāi)發(fā)的前景。S.albulus 1-25菌株代謝產(chǎn)生ε-polylysine，ε-PL具有抑菌譜廣（對(duì)G+和G-細(xì)菌、真菌均有抑菌效果）、水溶性好、安全性高、熱穩(wěn)定性好、抑菌 pH范圍廣、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)［6-7］。但S.albulus 1-25菌株產(chǎn)生的ε-PL存在分子量大、抑菌效果稍弱的缺點(diǎn)，生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)酸少，培養(yǎng)過(guò)程中易染菌。因此，進(jìn)行菌株的改造是必然之勢(shì)。具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的L.paracasei HD1-7菌株產(chǎn)生的副干酪乳桿菌素具有在酸性條件下對(duì)大多數(shù)的 G+和G-細(xì)菌有很好的抑菌效果，菌株生長(zhǎng)周期短，產(chǎn)酸多，生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但副干酪乳桿菌素存在于中性及堿性條件下不抑菌、對(duì)真菌無(wú)抑制能力等缺點(diǎn)［8-10］。也就是說(shuō)，2株菌在培養(yǎng)和產(chǎn)物特性的方面具有很好的互補(bǔ)性。原生質(zhì)體融合技術(shù)可在不知道雙親株遺傳背景的情況下，實(shí)現(xiàn)雙親基因組融合、DNA交換、重組并產(chǎn)生新性狀。原生質(zhì)體融合技術(shù)具有廣泛適應(yīng)性和隨機(jī)性，可實(shí)現(xiàn)常規(guī)雜交方法無(wú)法做到的種間、屬間、門(mén)間甚至跨界的遠(yuǎn)緣雜交，并可以大幅度提高親本之間的重組頻率，集中雙親株優(yōu)良性狀的機(jī)會(huì)更大［11-13］。因此，本課題采用L.paracasei HD1-7與S.albulus 1-25原生質(zhì)體融合育種方法，是選育優(yōu)良天然防腐劑產(chǎn)生菌株的理想策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

親本菌株L.paracasei HD1-7 黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離，對(duì)潮霉素的最高耐藥濃度為5000μg/mL，對(duì)卡那霉素的最高耐藥濃度為10μg/mL；S.albulus 1-25 黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，對(duì)潮霉素（Hym）的最高耐藥濃度為10μg/mL，對(duì)卡那霉素（Km）的最高耐藥濃度為100μg/mL；指示菌株 Bacillus subtilis、Escherichia.coli、Saccharomyces cerevisiae 本院微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；Staphylococcus aureus、Micrococcus flavus 黑龍江省微生物研究所提供；Bacillus megaterium、Listeria sp.、Salmonella sp.、Proteus vulgaris、Shigella sp.、Bacillus cereus 哈醫(yī)大二院贈(zèng)送；培養(yǎng)基 M6培養(yǎng)基［14］，酵母膏-麥芽粉培養(yǎng)基［15］，S培養(yǎng)基［16］，種子培養(yǎng)基［6］；L.paracasei HD1-7再生培養(yǎng)基 a.再生培養(yǎng)基1-改良M6培養(yǎng)基，在M6培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2.5%明膠，蔗糖0.5mol/L，5mL 2%的無(wú)菌牛血清白蛋白；b.再生培養(yǎng)基2-乳酸菌原生質(zhì)體再生固體培養(yǎng)基［12］；c.再生培養(yǎng)基3-改良MRS再生培養(yǎng)基［12］；溶菌酶（lysozyme） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；Marker-DL-2000（Cat#MD 114）、2×Taq PCR MasterMix（Cat#KT-201） TIANGEN公司；P緩沖溶液［17］，HM液［18］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體的制備與再生L.paracasei HD1-7菌株在M6液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20h，4000r/min離心10min，棄上清液收集菌體后，用 HM液洗滌2次，再用 HM液稀釋制成108cfu/mL菌懸液。加入溶菌酶，在適宜的溫度條件下水浴酶解，用平皿裂解法［21］統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的制備率；采用雙層平板法［21］再生原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體制備率（%）=（酶解前的菌落數(shù)-酶解后的菌落數(shù)）/酶解前的菌落數(shù)×100%

再生率（%）=［從平皿上算得的總菌數(shù)-總菌數(shù)×（1-制備率）］/（總菌數(shù)×制備率）×100%

1.2.2 S.albulus 1-25原生質(zhì)體的制備 從S.albulus斜面上刮取全部孢子，用無(wú)菌水制成粗制孢子懸液，激烈振蕩后用塞有脫脂棉的一次性注射器過(guò)濾到無(wú)菌離心管中，6000r/min離心10min，使孢子沉淀，棄上清，加入4mL無(wú)菌水輕微振蕩后，取2mL孢子懸液接種于50mL種子培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48h。

以10%的接種量將種子液接入到25mL添加10.3%蔗糖的S培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)液6000r/min離心10min，收集S.albulus 1-25菌絲體，并用15mL蔗糖溶液洗滌沉淀2次，將菌絲體懸于4mL溶菌酶溶液中，水浴酶解，吹吸，保溫15min，補(bǔ)加5mL P緩沖液，用差速離心法（3500r/min，7min；6000r/min，10min）除去未酶解的菌絲體，收集原生質(zhì)體。血球計(jì)數(shù)計(jì)算原生質(zhì)體形成量。

1.2.3 L.paracasei HD 1-7與S.albulus 1-25的原生質(zhì)體融合 取雙親株原生質(zhì)體各1mL混合，加入2mL 50%的PEG（MW2000）溶液，20℃水浴3min，取出6500r/min離心10min，HM液離心洗滌2次，用HM液稀釋10-4～10-6，涂于改良的M6平板上，37℃培養(yǎng)，計(jì)算原生質(zhì)體融合率。

原生質(zhì)體融合率（%）=（再生平皿上的總菌落數(shù)-雙親裂解剩余菌落數(shù)）/［單方（較少方）原生質(zhì)體再生數(shù)］×100%

1.2.4 融合子的篩選與鑒定 將再生菌落用無(wú)菌牙簽依次點(diǎn)接到分別含有50μg/mL的卡那霉素、潮霉素、卡那霉素和潮霉素及無(wú)抗生素的M6培養(yǎng)基上，在兩種抗生素選擇性培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)或都不能生長(zhǎng)的菌落可初步判斷為融合子。將獲得的融合子連續(xù)傳代10次，再檢測(cè)其抗藥性的穩(wěn)定性。

以親株L.paracasei HD1-7作對(duì)照，采用雙層平板法［8］檢測(cè)融合子對(duì) B.subtilis、S.aureus、M.flavus、E.coli、 S.cerevisiae、 L.plantarum、 S. albulus、 B. megaterium、Listeria sp.、Salmonella sp.、P.vulgaris、Shigella sp.、B.brevis的抑菌能力；以B.subtilis為指示菌，檢測(cè)融合子在pH在3、5、7條件下的抑菌效果。

提取S.albulus 1-25、L.paracasei HD1-7及融合子R1、R2、R3的總DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)［19-20］，比較其DNA總量，鑒定是否為融合子。

2 結(jié)果與討論

2.1 L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體制備與再生條件的確定

2.1.1 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 酶解溫度可直接影響到酶促反應(yīng)的速率和原生質(zhì)體化的程度，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到溶菌酶的解離基團(tuán)的狀態(tài)和活性基團(tuán)的作用。如圖1所示，30℃和37℃條件下原生質(zhì)體的制備率均較高，但37℃時(shí)再生率更高，為25.9%，因此確定37℃為最佳酶解溫度。

圖1 酶解溫度對(duì)L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體制備和再生的影響

2.1.2 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 原生質(zhì)體形成率在一定范圍內(nèi)與溶菌酶的濃度成正比。但溶菌酶濃度過(guò)高，雖然原生質(zhì)體形成率高，而由于溶菌酶中往往含有一些對(duì)原生質(zhì)體有害的酶類(lèi)（如過(guò)氧化物酶、核糖核酸酶等），因此，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，必然會(huì)嚴(yán)重地影響原生質(zhì)體的活性；而且酶量過(guò)大會(huì)使細(xì)菌脫壁太徹底，失去了原生質(zhì)體再生時(shí)合成細(xì)胞壁的引物，易使菌體凝集，降低原生質(zhì)體的再生率；溶菌酶濃度低，則原生質(zhì)體形成率低，影響融合［21-23］。從圖2可以看出，隨著溶菌酶濃度的增加，原生質(zhì)體形成率不斷提高，但再生率卻隨著酶濃度的增加依次下降，當(dāng)溶菌酶濃度為2mg/mL時(shí)再生率最高，為22.7%，因此確定2mg/mL為最佳酶濃度。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 圖3表明，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，原生質(zhì)體制備率越高，而再生率越低。酶解1～5h時(shí)的制備率從68.1%、69.5%升高到72.95%，再生率從21.5%、23.2%降低到9.2%。原因

同溶菌酶濃度過(guò)高一樣，降低了原生質(zhì)體的活性，因此確定酶解時(shí)間為3h。

圖2 酶的濃度對(duì)L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體制備和再生的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體制備和再生的影響

2.1.4 再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 再生培養(yǎng)基是原生質(zhì)體進(jìn)行再生過(guò)程的最重要的外界環(huán)境因素之一，它對(duì)原生質(zhì)體既有維系保護(hù)的作用，又有支持的功效和營(yíng)養(yǎng)功能，它直接關(guān)系到再生率的高低。如圖4所示，再生培養(yǎng)基1-改良M6培養(yǎng)基的再生率最高達(dá)28%。明膠和牛血清白蛋白的作用是既可起到對(duì)原生質(zhì)體保護(hù)劑的作用，同時(shí)也可以起到原生質(zhì)體擴(kuò)張劑的作用，刺激原生質(zhì)體的再生過(guò)程，因此在L.paracasei HD1-7生長(zhǎng)良好的M6培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加上明膠、牛血清白蛋白和0.5mol/L蔗糖創(chuàng)造的高滲環(huán)境，很適宜原生質(zhì)體再生。

圖4 不同再生培養(yǎng)基對(duì)L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體再生的影響

2.1.5 再生溫度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 再生溫度對(duì)再生率的影響效果與原來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的溫度有關(guān)，一般認(rèn)為最佳的再生溫度低于菌體適宜培養(yǎng)溫度。從圖5可以看出，35℃條件下的再生率最高達(dá)43.7%，因此確定35℃為最佳再生溫度。

經(jīng)以上各條件摸索，確定L.paracasei HD1-7的最佳原生質(zhì)體條件為：37℃酶解、溶菌酶濃度為2mg/mL、酶解時(shí)間為3h、改良M6培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基、35℃再生，在此條件下可使原生質(zhì)體的制備率達(dá)70%以上，再生率達(dá)40%以上。

2.2 S.albulus 1-25原生質(zhì)體制備條件的確定

圖5 再生溫度對(duì)L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體再生的影響

2.2.1 S.albulus 1-25的生長(zhǎng)曲線 由圖6可知，S.albulus 1-25菌株在0～12h為延遲生長(zhǎng)期，12～36h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36～60h為穩(wěn)定生長(zhǎng)期，培養(yǎng)64h后進(jìn)入衰退期。

圖6 S.albulus 1-25菌株的生長(zhǎng)曲線

2.2.2 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 一般認(rèn)為菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期制備原生質(zhì)體最適宜，菌齡對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響見(jiàn)圖7，培養(yǎng)40h時(shí)，形成的原生質(zhì)體最多，為4.675×107cfu/mL。因此，確定最佳菌齡為40h，即為穩(wěn)定生長(zhǎng)期的初期。

圖7 菌齡對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響

2.2.3 甘氨酸對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 放線菌在加入甘氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，易于使細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松動(dòng)，釋放原生質(zhì)體。甘氨酸對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響見(jiàn)圖8，隨著加入甘氨酸量的增多，原生質(zhì)體形成量不斷增多，直至添加量為2.0%時(shí)，達(dá)到最高值5.275×107cfu/mL。添加甘氨酸后，發(fā)酵液的狀態(tài)也有所改變，菌絲結(jié)塊、掛壁現(xiàn)象減少，菌絲分散更加均勻。

圖8 甘氨酸添加量對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響

2.2.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 不同的酶具有各自不同的最適溫度，同時(shí)還要注意菌株生長(zhǎng)的最適溫度，以避免因溫度不當(dāng)而導(dǎo)致原生質(zhì)體活性降低，甚至破壞，因此確定酶解溫度通常要二者兼顧，這對(duì)水解細(xì)胞壁是至關(guān)重要的。酶解溫度對(duì)S. albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響見(jiàn)圖9，35℃酶解時(shí)原生質(zhì)體形成率最高，為4.975×107cfu/mL，因此確定為最佳酶解溫度。

圖9 酶解溫度對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響

2.2.5 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 原生質(zhì)體制備時(shí)，酶的濃度要適當(dāng)。酶量過(guò)低，作用不徹底，不利于原生質(zhì)體形成；濃度過(guò)高，又會(huì)影響原生質(zhì)體數(shù)量和活性，致使再生頻率下降。酶濃度對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響見(jiàn)圖10，可看出隨酶濃度增加，原生質(zhì)體形成量不斷增加，酶濃度達(dá)到2.0mg/mL后，原生質(zhì)體形成量不再增加，為1.34×108cfu/mL，因此確定最佳酶濃度為2.0mg/mL。

圖10 酶濃度對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響

2.2.6 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 充足的酶解時(shí)間是細(xì)菌原生質(zhì)體化的必要條件，原生質(zhì)體形成率隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但再生率會(huì)由于隨酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞壁脫壁徹底無(wú)法再生而降低。酶解時(shí)間對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響見(jiàn)圖11，酶解180min后，原生質(zhì)體的數(shù)量大大增加，達(dá)到1.74×108cfu/mL。為避免酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)原生質(zhì)體破壞過(guò)度，影響融合，確定酶解時(shí)間為180min。

圖11 酶解時(shí)間對(duì)S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量的影響

經(jīng)以上各條件摸索，確定最佳酶解條件：菌齡為40h，甘氨酸添加量為2.0%，酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為 180min，溶菌酶濃度為 2.0mg/mL，可使S.albulus 1-25原生質(zhì)體形成量達(dá)1.7×108cfu/mL。

2.3 融合子的篩選及鑒定

檢出和鑒別融合重組體細(xì)胞的主要依據(jù)是親本的遺傳標(biāo)記，同時(shí)還要結(jié)合DNA的含量和孢子形態(tài)等遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)方面特性加以確定。本課題結(jié)合了親本抗藥性標(biāo)記、菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、DNA含量、穩(wěn)定性等方面對(duì)融合子進(jìn)行了鑒定，以確保獲得的融合子為穩(wěn)定遺傳的目的重組子。

2.3.1 融合子的篩選 本實(shí)驗(yàn)的目的是只篩選L.paracasei HD1-7作為受體的融合子。由于L.paracasei HD1-7和S.albulus 1-25的菌體形態(tài)、菌落形態(tài)相差懸殊，因此非常容易區(qū)分L.paracasei HD1 -7作為受體的再生菌落。而且改良的M6雙層再生平板及37℃再生培養(yǎng)溫度等均是L.paracasei HD1-7作為受體的融合子的最佳再生條件，S.albulus 1-25作為受體的融合子生長(zhǎng)會(huì)很緩慢，一般在培養(yǎng)3d后才出現(xiàn)。因此，篩選時(shí)只選擇前3d出現(xiàn)的菌落形態(tài)類(lèi)似L.paracasei HD1-7的菌株進(jìn)行鑒定。

抗藥性標(biāo)記篩選結(jié)果見(jiàn)表1，先后對(duì)12478個(gè)再生菌落進(jìn)行抗藥性標(biāo)記的篩選，獲得帶有雙標(biāo)記的融合子465個(gè)，融合率為3.7%，經(jīng)10代抗藥性穩(wěn)定性檢測(cè)，有65個(gè)重組體能夠保持雙標(biāo)記抗生素抗性，占初篩融合子的1.4%，融合率為0.52%。

表1 融合子篩選結(jié)果

2.3.2 融合子的抑菌能力 首先以B.subtilis（G+細(xì)菌）、E.coli（G-細(xì)菌）和S.cerevisiae（真菌）為指示菌對(duì)穩(wěn)定的重組體進(jìn)行抑菌能力測(cè)定，結(jié)果有3個(gè)重組體（命名為R1、R2、R3）從親株S.albulus 1-25獲得了對(duì)酵母菌的抑菌基因，使其抑菌范圍擴(kuò)寬。這3株融合子對(duì)其他指示菌的抑菌效果見(jiàn)表2，由表可知R3對(duì)多個(gè)菌株的抑菌能力均超過(guò)了親株。抑菌最適pH實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖12）表明，3株融合子在中性條件下仍不具抑菌活性。

2.3.3 融合子與親株的形態(tài)學(xué)特征比較 融合子與親株的形態(tài)學(xué)見(jiàn)表3，結(jié)果表明融合子在表型上均發(fā)生了變化，菌體和菌落面積均變大。

2.3.4 總DNA含量比較進(jìn)一步鑒定融合子 提取S.albulus 1-25、L.paracasei HD1-7、融合子R1、R2、R3的總DNA，計(jì)算得到A260/A280值均在1.8±0.2范圍內(nèi)，純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。由表4可看出，融合子R1、R2、R3的A260值大于雙親株的A260值，而又介于雙親株的A260值和之間，說(shuō)明融合子R1、R2、R3的DNA總量較親株增多，確實(shí)發(fā)生了融合，是重組體。

由電泳圖13可觀察到，融合子總DNA的亮度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于親株L.paracasei HD1-7總DNA，也說(shuō)明了融合子R1、R2、R3的DNA總量較親株增多，進(jìn)一步證明了R1，R2，R3為融合子。

3 結(jié)論

選用溶菌酶濃度為2mg/mL，酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間3h，使L.paracasei HD1-7原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，制備率達(dá)70%以上；再生培養(yǎng)基為改良的M6培養(yǎng)基，再生溫度37℃，此時(shí)再生率達(dá)40%以上。采用S.albulus 1-25穩(wěn)定生長(zhǎng)初期的菌絲，添加量2.0%的甘氨酸，溶菌酶濃度2.0mg/mL，酶解溫度35℃，酶解時(shí)間 180min，使原生質(zhì)體形成達(dá)到最高 1.74× 108cfu/mL。兩親株都隨著酶濃度、酶解溫度和時(shí)間的增加，原生質(zhì)體形成率不斷提高，但原生質(zhì)體再生率升高到一定程度會(huì)下降。

重組子R1、R2、R3具有雙親株的優(yōu)良性狀，獲得了來(lái)自S.albulus 1-25的抑酵母菌基因，使其抑菌范圍擴(kuò)寬，且為遺傳穩(wěn)定性菌株。

表2 重組體對(duì)各指示菌的抑菌效果

表3 融合子與雙親株的形態(tài)學(xué)特征比較

表4 雙親株和融合子總DNA紫外檢測(cè)結(jié)果

圖12 重組體在pH為3、5、7條件下的抑菌效果（B.subtilis）

圖13 重組體總DNA的電泳圖

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Breeding strains of excellent biopreservative by L.paracasei HD1-7 and S.albulus 1-25 protoplast fusion

LEI Hong，ZHANG Tie-dan，JIN Zhong-bin，ZHUANG Hai-ji，HE Xin，ZHANG Ji-liang，PING Wen-xiang*，ZHOU Dong-po*
（Key Laboratory of Microbial，College of Life Science，Heilongjiang University，Harbin 150080，China）

ln order to obtain microbial preservative with excellent applicability，L.paracasei HD1-7 and S.albulus 1-25 were used as parents to construct strains through protoplast fusion technique.Optimal protoplast fusion conditions were systematically investigated.Through phenotype characteristic，antibacterial spectrum，drug resistance property and DNA content，3 optimal fusants were identified.The fusants had the gene of inhibiting yeast from S.albulus 1-25.

L.paracasei HD1-7；S.albulus 1-25；biopreservative；protoplast fusion；fusant identification

TS202.3

A

1002-0306（2011）01-0146-06

2010-02-04 *通訊聯(lián)系人

雷虹（1971-），女，博士，副教授，碩導(dǎo)，研究方向：食品微生物。

黑龍江省科技廳重大攻關(guān)項(xiàng)目（GA07B401）；黑龍江省科技廳重大攻關(guān)項(xiàng)目（GB05B401）；哈爾濱市科技局科技攻關(guān)項(xiàng)目（2009AA3CN079）；黑龍江省科技廳青年基金項(xiàng)目（QC03C24）。