齊海萍，胡文忠，姜愛(ài)麗，田密霞

（大連民族學(xué)院教育部國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600）

不同氮源發(fā)酵生產(chǎn)豆豉纖溶酶的紫外吸收光譜研究

齊海萍，胡文忠*，姜愛(ài)麗，田密霞

（大連民族學(xué)院教育部國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600）

采用紫外在線檢測(cè)方法，對(duì)豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌UγD8菌株在不同氮源下連續(xù)發(fā)酵56h，對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，以酵母膏為氮源發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間44h，吸光度Abs最大，為1.4002；以豆?jié){為氮源發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間為36h，Abs為1.0557；以豆渣為氮源發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間為48h，Abs為1.3301。所用枯草桿菌UγD8發(fā)酵生產(chǎn)豆豉纖溶酶的最佳氮源為酵母膏，產(chǎn)酶量大，但產(chǎn)酶時(shí)間晚。其利用率順序?yàn)榻湍父啵径乖径節(jié){。選用紫外吸收光譜技術(shù)用于檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)氮源消耗以及豆豉纖溶酶的產(chǎn)生等動(dòng)態(tài)變化，得到較為理想的結(jié)果，且方便快捷，靈敏度高，可以廣泛用于發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)測(cè)。

UγD8菌株，紫外吸收光譜，氮源

豆豉纖溶酶是一種絲氨酸蛋白激酶，是從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品淡豆豉中提取得到的，豆豉纖溶酶具有與鏈激酶、尿激酶等溶血栓藥物同樣的溶解血栓作用，比之現(xiàn)用于臨床的溶血栓藥物，豆豉纖溶酶具有安全性好，易被人體吸收，作用直接迅速，作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可由微生物發(fā)酵生產(chǎn)因而造價(jià)低廉等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有潛力的新型溶血栓藥物［1-2］。近幾年，隨著檢測(cè)儀器的精密化和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的迅速發(fā)展，發(fā)酵過(guò)程在線檢測(cè)的研究逐漸深入，一些新興的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如紅外光譜技術(shù)［3-6］、熒光分析法、離子敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管技術(shù)、核磁共振技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、色譜分析技術(shù)等。本文研究了發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液紫外吸收光譜的變化，分析比較了發(fā)酵液吸收光譜的變化與細(xì)菌生長(zhǎng)以及發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血纖維蛋白原 購(gòu)自Sigma公司；牛凝血酶 購(gòu)自天津血研所；其它藥品 均為國(guó)產(chǎn)分析純；產(chǎn)酶菌UγD8菌株 本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得；種子培養(yǎng)基Ⅰ（g/L）葡萄糖 1.5，豆餅粉 2，KH2PO40.1，K2HPO40.25，MgSO45H2O 0.05，酵母膏提取物0.15，pH 7，121℃，20min；發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ（g/L） 葡萄糖1.5，KH2PO40.1，K2HPO40.25，MgSO4·5H2O 0.05，pH 7，121℃，20min；液體培養(yǎng)基Ⅲ 在發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中添加20g/L的不同氮源，酵母膏，豆渣，豆?jié){。

電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺(tái) 安泰公司；BR4i型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 法國(guó)Jouan公司；UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；UV-2550雙光束紫外光分光光度計(jì) 日本島津；pHS-3C精密pH計(jì)上海三北儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，37℃，250r·min-1培養(yǎng)8h，然后以4%的接種量分別接入不同的液體培養(yǎng)基Ⅲ中，37℃，250r·min-1培養(yǎng)56h，每隔4h取1mL發(fā)酵液進(jìn)行以下研究。

1.2.2 豆豉纖溶酶發(fā)酵液紫外吸收光譜的測(cè)定 取適量發(fā)酵液，4℃，8000r·min-1離心10min，取上清，雙蒸水稀釋25倍進(jìn)行紫外光譜掃描，其參比為蒸餾水。分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)定：中速掃描，掃描范圍220～320nm，采樣間隔1nm，光譜帶寬0.1nm。

1.2.3 豆豉纖溶酶活性測(cè)定方法 采用纖維蛋白平板法進(jìn)行［7］。

1.2.4 發(fā)酵過(guò)程中菌體濃度的測(cè)定［7］取培養(yǎng)不同時(shí)間的發(fā)酵液加雙蒸水稀釋20倍，以同樣稀釋20倍沒(méi)有接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，660nm測(cè)定OD值，以O(shè)D值表示菌體濃度的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 以酵母膏為唯一氮源發(fā)酵液的紫外掃描分析

圖1為發(fā)酵0～56h發(fā)酵液的紫外吸收情況。由圖1（a）可以看出：發(fā)酵前4h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax在258nm左右沒(méi)有變化，只是其吸收強(qiáng)度顯著下降，Abs由1.2561降為1.0260，說(shuō)明發(fā)酵前4h內(nèi)發(fā)酵液中沒(méi)有新物質(zhì)成分的生成，只是原有組分的消耗；圖1中（b）為發(fā)酵4、8h時(shí)發(fā)酵液的紫外吸收光譜，λmax由258nm位移至266nm，其吸收峰的位置紅移了8nm左右，可以推斷在4～8h內(nèi)發(fā)酵液中的氨基酸，特別是芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸的組成以及含量發(fā)生變化，可能有新物質(zhì)的產(chǎn)生；圖1中（c）為發(fā)酵12、16、28、32h時(shí)發(fā)酵液的紫外吸收情況，可以看出在發(fā)酵16～32h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax穩(wěn)定在265nm左右，其吸收強(qiáng)度在逐漸上升，Abs由1.0839升為1.3828，說(shuō)明了發(fā)酵產(chǎn)生新物質(zhì)的含量在不斷升高；圖1中（d）為發(fā)酵末期44、48、56h時(shí)發(fā)酵液的紫外吸收情況，λmax雖然沒(méi)變，但是其吸收強(qiáng)度卻有所下降，可能是新物質(zhì)的含量降低造成的。

圖1 氮源為酵母膏的紫外掃描結(jié)果

2.2 以豆渣為唯一氮源發(fā)酵液的紫外掃描分析

由圖2可以看出，氮源為豆渣時(shí)，發(fā)酵前8h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax穩(wěn)定在257nm，Abs有所下降；至發(fā)酵24h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax移至265nm處；發(fā)酵24～40h，λmax沒(méi)有變化，Abs由0.8028升至1.3135；發(fā)酵44h以后，Abs有小幅度下降，說(shuō)明所產(chǎn)生的新物質(zhì)已開(kāi)始減少。

圖2 氮源為豆渣的紫外掃描結(jié)果

2.3 以豆?jié){為唯一氮源發(fā)酵液的紫外掃描分析

由圖3可以看出，氮源為豆?jié){時(shí)，發(fā)酵液紫外吸收的吸收強(qiáng)度明顯較低，且發(fā)酵40h以后，Abs已開(kāi)始下降，說(shuō)明所產(chǎn)生的新物質(zhì)已開(kāi)始減少。

圖3 氮源為豆?jié){的紫外掃描結(jié)果

2.4 豆豉纖溶酶發(fā)酵中菌體濃度以及產(chǎn)酶量的變化

豆豉纖溶酶發(fā)酵56h內(nèi)菌體濃度的變化見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，2～12h為細(xì)菌生長(zhǎng)的指數(shù)期。該時(shí)期細(xì)胞生長(zhǎng)速率最大、酶系活躍、代謝旺盛，發(fā)酵液中的各營(yíng)養(yǎng)成分消耗較為顯著，發(fā)酵液中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比都將發(fā)生顯著改變，其中有機(jī)氮源物質(zhì)的含量以及所占比例的變化將會(huì)影響其紫外吸收光譜。豆豉纖溶酶發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液相對(duì)酶活的變化，見(jiàn)圖5。

圖4 豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌UγD8發(fā)酵56h內(nèi)菌體濃度的變化

圖5 豆豉纖溶酶發(fā)酵過(guò)程中酶活力的變化

豆豉纖溶酶發(fā)酵過(guò)程中酶活力的變化（見(jiàn)圖5）。發(fā)酵前12h主要為細(xì)菌生長(zhǎng)階段，基本不產(chǎn)生豆豉纖溶酶。圖5顯示，豆豉纖溶酶發(fā)酵0～8h發(fā)酵液的相對(duì)酶活幾乎為0；發(fā)酵8h時(shí)開(kāi)始檢測(cè)到發(fā)酵液中存在豆豉纖溶酶，但相對(duì)酶活較低；在發(fā)酵20～44h內(nèi)，豆豉纖溶酶的酶活迅速增加，說(shuō)明發(fā)酵液中豆豉纖溶酶的濃度迅速上升。發(fā)酵的最后階段44～56h內(nèi)，所檢測(cè)到發(fā)酵液的相對(duì)酶活降低了，可能是由于發(fā)酵末期豆豉纖溶酶產(chǎn)量降低以及部分降解所致。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明：不同氮源對(duì)發(fā)酵特性的影響非常明顯。

豆豉纖溶酶發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液紫外吸收光譜呈現(xiàn)以上變化的原因?yàn)椋喊l(fā)酵前期，發(fā)酵液紫外吸收的波峰位置基本沒(méi)有變化，只是其吸收強(qiáng)度顯著下降，是由于細(xì)菌生長(zhǎng)在該時(shí)間段處于指數(shù)期，細(xì)胞代謝旺盛，大量消耗發(fā)酵液中各營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致氮源物質(zhì)的含量顯著降低，所以發(fā)酵液的紫外吸收強(qiáng)度顯著下降。發(fā)酵前中期（大約8～20h）內(nèi)發(fā)酵液紫外吸收的波峰位置發(fā)生了位移，是由于該時(shí)間段發(fā)酵產(chǎn)生了新物質(zhì)豆豉纖溶酶，新蛋白的產(chǎn)生使得發(fā)酵液中氨基酸的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，特別是芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸的含量發(fā)生變化導(dǎo)致了發(fā)酵液紫外吸收光譜發(fā)生了改變。發(fā)酵中期發(fā)酵液紫外吸收強(qiáng)度顯著升高，因?yàn)樵摃r(shí)間段剛好是發(fā)酵液酶活迅速增加的時(shí)期，發(fā)酵液中豆豉纖溶酶含量不斷增加導(dǎo)致了紫外吸收強(qiáng)度的逐漸升高。發(fā)酵末期，由于部分豆豉纖溶酶的降解致使發(fā)酵液紫外吸收強(qiáng)度下降，因此，為了酶的高產(chǎn)高收，發(fā)酵時(shí)間至末期應(yīng)即時(shí)停止發(fā)酵，分離提取產(chǎn)物酶。

同時(shí)，我們從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中也可以發(fā)現(xiàn)，不同氮源發(fā)酵，其開(kāi)始產(chǎn)生新物質(zhì)（即豆豉纖溶酶）的時(shí)間是不同的，豆?jié){產(chǎn)酶時(shí)間較早。所產(chǎn)酶量也有很大不同（見(jiàn)表1）：酵母膏發(fā)酵44h的Abs最大，為1.4002；豆?jié){，36h，1.0557；豆渣，48h，1.3301。由此，我們可以得到以下結(jié)論，所用枯草桿菌UγD8發(fā)酵生產(chǎn)豆豉纖溶酶的最佳氮源為酵母膏，產(chǎn)酶量大，但產(chǎn)酶時(shí)間晚，其利用率順序?yàn)榻湍父啵径乖径節(jié){。

表1 不同氮源對(duì)酶發(fā)酵特性的影響

［1］王金英，劉宇峰.豆豉抗栓作用的研究［J］.生物技術(shù)，1997，7（5）：18-20.

［2］張萍萍.纖溶酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)初探［D］.河北大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［3］邱江，潘紅春，韓崇家，等.紅外光譜監(jiān)測(cè)糖化酶發(fā)酵過(guò)程［J］.光譜學(xué)與光譜分析，1999，19（6）：831-833.

［4］葛向紅，趙元黎，張鳳秋，等.癌細(xì)胞對(duì)血清光譜的影響［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，24（7）：841-843.

［5］趙元黎，張鳳秋，葛向紅，等.細(xì)胞培養(yǎng)基的吸收光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，24（8）：907-909.

［6］薛萍，鄭文杰.紫外可見(jiàn)光譜在生物無(wú)機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用［J］.廣州化工，2002，30（4）：79-82.

［7］齊海萍.豆豉纖溶酶的制備、酶學(xué)特性及功能性質(zhì)研究［D］.江南大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

Study on fermentation liquid’s absorption spectra in dochi fibrinolytic enzyme fermentation with various nitrogen sources

QI Hai-ping，HU Wen-zhong*，JIANG Ai-li，TIAN Mi-xia
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Education Department and National Nationality Key Lab，Dalian 116600，China）

UV line detection method was utilized in this experiment，strain UγD8 with high productive fibrinolytic enzyme fermented for 56h under various nitrogen sources，the fermentation liquid was detected by UV every 4h. Conclusions showed as below：when yeast extract as nitrogen source，after fermentation for 8h，the new material began to produce，after fermentation for 44h，maximum absorbance（1.4002）appeared，fermentation end，the absorbance decreased.When soybean milk was the sole nitrogen source，the time of new material started to produce was at 4h fermented，in the 36h，absorbance value achieved maximum（1.0557）.Soybean dreg as nitrogen sources，when fermented for 4h，the broth generated new material，in the 48h，the absorbance value climaxed at 1.3301.

strain UγD8；UV absorption spectrum；nitrogen source

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）01-0175-03

2009-12-17 *通訊聯(lián)系人

齊海萍（1973-），女，博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)。

遼寧省教育廳基金項(xiàng)目（2008135）。