林秀椿，高剛峰，陳美高，倪 莉

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院食品技術(shù)研究所，福建福州350108；2.三明市林業(yè)科技推廣中心，福建三明365000）

油茶餅粕蛋白提取及抗氧化酶解產(chǎn)物的制備

林秀椿1，高剛峰2，陳美高2，倪 莉1

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院食品技術(shù)研究所，福建福州350108；2.三明市林業(yè)科技推廣中心，福建三明365000）

測(cè)定油茶餅粕的基本組成；確定茶粕蛋白提取的方法和工藝及其測(cè)定方法；通過微生物發(fā)酵、酶解等方法生產(chǎn)茶粕蛋白多肽，測(cè)定經(jīng)處理后蛋白分子量分布情況，并測(cè)定其清除DPPH·和羥自由基能力。實(shí)驗(yàn)表明，茶粕營養(yǎng)豐富，通過堿液水浴浸提可獲得18.70%蛋白質(zhì)，浸提液酶解后可制備具有抗氧化能力的酶解產(chǎn)物，抗氧化能力隨著水解時(shí)間呈先增后減的趨勢(shì)，而茶粕經(jīng)發(fā)酵后能得到較大比例的低分子量產(chǎn)物。油茶餅粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值還有待進(jìn)一步開發(fā)。

油茶餅粕，蛋白質(zhì)，酶解，抗氧化肽

油茶（Camellia Oleifera Abel）系山茶科山茶屬植物，是一種常綠、長(zhǎng)壽、果實(shí)含油率高的中國特有的油料樹種，也是與油棕、橄欖、椰子齊名的四大木本食用油源樹種之一［1］。油茶餅粕又稱茶餅、茶粕、枯餅等，榨取茶油后剩下的渣餅即是油茶餅粕，其數(shù)量相當(dāng)于茶油的三倍，我國油茶餅粕的年平均產(chǎn)量約為40萬t［2］。由于我國油茶茶籽主要采用傳統(tǒng)榨油工藝制油，所生產(chǎn)的茶粕中茶皂素、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過高，不適宜直接用于動(dòng)物生產(chǎn)，大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，甚至廢棄，少量用于茶皂素的提取，極少部分用作飼料。有研究報(bào)道茶粕營養(yǎng)豐富，因而茶粕的廢棄是資源的極大浪費(fèi)，甚至對(duì)環(huán)境也構(gòu)成了極大壓力。目前關(guān)于茶粕的研究較少，少數(shù)幾篇油茶餅粕蛋白提取的研究主要是采用堿提酸沉的方法獲得蛋白質(zhì)，由于不同的蛋白等電點(diǎn)不同，因而該法一般不能得到茶粕中全部的蛋白質(zhì)。本研究充分利用了茶籽油產(chǎn)品的副產(chǎn)物油茶餅粕，擬通過發(fā)酵、酶解等樣品處理方式從中獲得抗氧化產(chǎn)物，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕 沈郎食用油公司提供，粉碎過篩待用；蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D 丹麥NOVE公司；紅曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉 實(shí)驗(yàn)室分離制備；無水乙醇、HCl、NaOH、石油醚等 均為分析純。

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；KDN-16C型數(shù)控消化爐 上海新嘉電子有限公司；V-1200型可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；MA35型水分快速測(cè)定儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品基本成分測(cè)定

1.2.1.1 水分含量測(cè)定 使用快速水分測(cè)定儀測(cè)定茶粕的水分含量。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［4］，采用半微量凱氏定氮法測(cè)定茶粕蛋白質(zhì)含量。

1.2.1.3 總糖含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［5-6］，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定茶粕樣品總糖含量。

1.2.1.4 脂肪含量測(cè)定 索氏提取法測(cè)定茶粕樣品脂肪含量。

1.2.1.5 總酚含量測(cè)定 參考中國藥典中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法。

1.2.1.6 灰分含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［4］所述方法測(cè)定茶粕灰分含量。

1.2.1.7 粗纖維含量測(cè)定 參考國標(biāo)GB/T5515中粗纖維含量測(cè)定方法。

1.2.2 茶粕蛋白的提取 采用蒸餾水、乙醇水和氫氧化鈉溶液三種不同溶劑水浴提取茶粕中的蛋白質(zhì)，對(duì)比不同溶劑浸提的蛋白提取率；此外還對(duì)比了水浴前未經(jīng)處理和高壓處理之后的提取效率。

1.2.3 提取工藝條件的優(yōu)化 分別考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取液濃度等因素對(duì)茶粕蛋白提取的影響，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)確定提取茶粕蛋白最優(yōu)條件，因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.4 茶粕蛋白浸提液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 對(duì)比茶粕蛋白浸提液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的三種方法：考馬斯亮藍(lán)法、福林酚法和凱氏定氮法。

1.2.5 茶粕蛋白水解產(chǎn)物的制備

1.2.5.1 茶粕的酶解工藝 根據(jù)確定的提取茶粕蛋白最優(yōu)工藝對(duì)茶粕進(jìn)行提取蛋白處理，酶解蛋白質(zhì)浸提液，工藝流程如下：

茶粕浸提液→調(diào)pH→加酶恒溫水解→滅酶→酶解液

1.2.5.2 茶粕的發(fā)酵工藝 采用微生物發(fā)酵法制備茶粕蛋白的水解產(chǎn)物，將產(chǎn)酶和酶解兩個(gè)步驟相結(jié)合。選取3株產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌種紅曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉。

茶粕培養(yǎng)基制備→滅菌→接種→發(fā)酵→烘干、粉碎→浸提液

1.2.6 茶粕蛋白水解產(chǎn)物的分離和抗氧化性質(zhì)的研究

1.2.6.1 隆丁區(qū)分法測(cè)定茶粕蛋白水解產(chǎn)物的高、中、低分子蛋白分布 其測(cè)定原理是高分子含氮物質(zhì)在酸性溶液中易為單寧所沉淀，磷鉬酸可同時(shí)沉淀高、中分子含氮物質(zhì)，低分子含氮物質(zhì)則不為上述試劑所沉淀。

1.2.6.2 茶粕蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7］，通過使用不同酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用得到茶籽多肽對(duì)DPPH·和羥自由基清除作用的測(cè)定，量化茶籽蛋白多肽抗氧化能力。

茶粕蛋白水解產(chǎn)物DPPH·清除能力測(cè)試見表2，清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ca-2mL DPPH溶液+2mL待測(cè)溶液的吸光值；Cb-2mL待測(cè)溶液+2mL乙醇的吸光值；C0-2mL DPPH溶液+2mL蒸餾水的吸光值。

表2 茶籽蛋白酶解物DPPH·清除能力測(cè)定

茶籽蛋白水解產(chǎn)物羥自由基清除作用的測(cè)定按表3的程序操作，添加后振蕩混合后靜置60min，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，清除率計(jì)算如下式：

式中：Ao-未加被測(cè)物吸光度值；As-加入被測(cè)物后吸光度值；Ai-樣品自身空白吸光值。

表3 羥自由基清除能力測(cè)定操作程序（mL）

2 結(jié)果與分析

2.1 茶粕基本成分分析

對(duì)茶粕基本組成成分進(jìn)行分析，其中粗蛋白含量9.78%，總糖含量32.02%，粗脂肪含量8.48%，三大營養(yǎng)物質(zhì)占50.28%，干重為56.03%，其他數(shù)據(jù)如表4所示，因此可以說茶粕蛋白中具有相當(dāng)可觀的營養(yǎng)價(jià)值有待開發(fā)。然而，茶粕中還含有兩大抗?fàn)I養(yǎng)因子茶皂素和單寧，這是茶粕不能被用作動(dòng)物飼料的重要原因。

2.2 茶粕蛋白提取方法的確定

通過蒸餾水、50%的乙醇溶液、氫氧化鈉溶液3種不同的浸提液對(duì)茶粕蛋白提取，結(jié)果如表5所示，堿提所得蛋白含量明顯高于其他兩種方法，堿提蛋白質(zhì)含量達(dá)到15.25%，而水提和醇提分別為9.66%、9.55%。

表4 茶粕的基本組成成分（%）

表5 不同提取茶粕蛋白方法的比較

2.3 提取茶粕蛋白最優(yōu)條件的確定

經(jīng)過料液比、堿液濃度、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素的單因素實(shí)驗(yàn)，初步確定提取參數(shù)的范圍，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各因素對(duì)其影響的主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞堿液濃度＞提取溫度＞料液比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知最優(yōu)水平組合為：提取料液比2%，堿液濃度3%，提取溫度80℃，提取時(shí)間120min。在此最佳工藝條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值18.70%。

表6 提取茶粕蛋白最佳條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 蛋白提取液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的對(duì)比

結(jié)合表7中數(shù)據(jù)，綜合考慮測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定過程中的可操作性、重現(xiàn)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性，福林酚法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)含量是較佳的選擇。

表7 蛋白提取液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的對(duì)比

2.5 茶粕蛋白水解物制備

按照確定的最優(yōu)工藝提取茶粕蛋白，在各酶最適作用條件下（如表8），分別添加蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D至蛋白濃度為0.88mg/mL的提取液中進(jìn)行水解，獲得酶解產(chǎn)物。

表8 酶解處理表

2.6 茶粕蛋白水解物的鑒定和分離

2.6.1 茶粕蛋白水解產(chǎn)物的高、中、低分子蛋白分布

隆丁區(qū)分法可以初步確定茶粕蛋白水解產(chǎn)物的高、中、低分子蛋白分布，如圖1所示，茶粕蛋白酶B酶解液中接近一半是中分子蛋白，22.39%是低分子蛋白，可能包括一些低分子蛋白、肽類物質(zhì)和游離氨基酸；高壓處理后再經(jīng)蛋白酶B作用的酶解液中高分子蛋白含量和中分子蛋白含量分別降低26.07%和38.72%，低分子蛋白含量明顯增大，增量達(dá)到96.10%，這驗(yàn)證了高壓處理有效促進(jìn)了酶解的結(jié)論；發(fā)酵后低分子蛋白含量達(dá)到49.38%，但是高分子蛋白含量達(dá)到48.15%，這可能是由于菌體本身蛋白含量比較高，因此高分子蛋白含量較高。

圖1 茶粕蛋白水解產(chǎn)物的高、中、低分子蛋白分布

2.6.2 不同蛋白酶解液的抗氧化活性 通過測(cè)定茶粕中蛋白酶解液的DPPH·和羥自由基清除活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茶粕中含有抗氧化性物質(zhì)，由圖2可知，清除能力為蛋白酶B＞蛋白酶C＞蛋白酶A＞蛋白酶D＞空白，即蛋白酶B所水解出來的多肽清除DPPH·的能力最強(qiáng)，而空白是不經(jīng)酶解直接將蛋白浸提液進(jìn)行DPPH·清除實(shí)驗(yàn)，也有一定的清除能力，說明浸提液中本身也含有少量具有抗氧化能力的成分，經(jīng)過酶解后其抗氧化能力得到了很大的提高，其中經(jīng)過蛋白酶B酶解后其抗氧化能力提高5.8倍，達(dá)到83.33%。

圖2 不同蛋白酶解液的抗氧化活性比較

2.6.3 抗氧化活性與水解時(shí)間的關(guān)系 以蛋白酶B為例，研究抗氧化活性與水解時(shí)間的關(guān)系。隨著酶解時(shí)間的推移，DPPH·的清除能力也是隨之而變化的，總體的趨勢(shì)是隨著酶解時(shí)間的增加，抗氧化性能先增高再降低，從圖3中的趨勢(shì)可以看到，并不是水解程度越高抗氧化活性就越高，這說明蛋白水解物的抗氧化活性成分可能是由幾個(gè)氨基酸排列形成的具有活性的肽類物質(zhì)。

圖3 水解時(shí)間與DPPH·清除活性的關(guān)系

3 結(jié)論

本研究通過測(cè)定茶粕中的基本組成，明確了茶粕可觀的營養(yǎng)價(jià)值。通過采用堿提、水提和醇提三種方法，從而篩選出適用于茶粕蛋白提取的方法，結(jié)果驗(yàn)證了茶粕蛋白中大部分蛋白質(zhì)易溶于堿液。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化茶粕蛋白提取的工藝條件，最優(yōu)條件為：提取料液比為2%，堿液濃度為3%，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為120min，其提取效果可以達(dá)到18.70%，而在水浴前對(duì)茶粕進(jìn)行高壓處理有助于蛋白更好地溶出。按照最優(yōu)工藝條件對(duì)茶粕樣品進(jìn)行提取蛋白，分別選用蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D四種酶對(duì)蛋白提取液進(jìn)行酶解，測(cè)定四種酶的DPPH·和羥自由基清除率，蛋白酶B的效果最好；隨著酶解時(shí)間的推移，DPPH·的清除能力先增高再降低。酶解后接近一半是中分子蛋白，22.39%是低分子蛋白。此外，發(fā)酵后低分子蛋白含量達(dá)到49.38%，但是高分子蛋白含量達(dá)到48.15%，這可能是由于菌體本身蛋白含量比較高?？傊?，油茶籽粕作為茶油提取的下腳料，來源充足，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，因而開發(fā)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有廣闊的前景。

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Study on extraction of protein and preparation of antioxidative peptide from Camellia Oleifera Abel

LIN Xiu-chun1，GAO Gang-feng2，CHEN Mei-gao2，NI Li1
（1.Institute of Food Science and Technology，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350108，China；2.Forestry Scienceamp;Technology Promotion Center，Sanming 365000，China）

Determined the basic composition of the oil-tea Camellia seed cake，found method and technology to extract protein，produced protein peptides through enzymolysis and fermentation，and analysed the distribution of different molecular weight proteins，then determined their inoxidabilities.Experimental data showed that，oil-tea Camellia seed cake had rich nutrition ingredients，through alkaline bath 18.70%protein can be obtained.Enzymatic hydrolysis of leaching liquor turned out to be antioxidative peptides，and DPPH· scavenging activities first increased and then decreased under different hydrolysis time，while the fermentation result got larger ratio of low molecular weight products.The economic value of oil-tea Camellia seed cake still needs further development.

oil-tea Camellia seed cake；protein；enzymolysis；antioxidative peptides

TS272

B

1002-0306（2011）01-0219-04

2009-12-28

林秀椿（1984-），女，碩士，研究方向：食物資源開發(fā)與利用。

福建省林業(yè)廳科研計(jì)劃項(xiàng)目基金資助（閩材料2009［8］號(hào)）。