張縱圓，張 玲，彭 秧

（1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊830002；2.新疆大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，新疆烏魯木齊830046）

紫花苜蓿中單寧的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化作用研究

張縱圓1，張 玲1，彭 秧2

（1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊830002；2.新疆大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，新疆烏魯木齊830046）

采用正交實(shí)驗(yàn)法研究紫花苜蓿中單寧的最佳提取工藝條件，探討了乙醇濃度、乙醇中鹽酸的濃度、提取溫度及提取時(shí)間四因素對(duì)紫花苜蓿中單寧提取量的影響。確立了紫花苜蓿中單寧最佳提取條件為：鹽酸濃度2.5%，乙醇濃度70%，提取溫度50℃，提取時(shí)間5h，測(cè)得紫花苜蓿中單寧提取量為2.15mg/g。并采用鄰苯三酚自氧化體系、Feton體系對(duì)紫花苜蓿中單寧的抗氧化活性進(jìn)行了研究，并同VC進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：紫花苜蓿中單寧對(duì)鄰苯三酚自氧化有抑制作用，對(duì)羥基自由基有良好的清除作用。

紫花苜蓿，單寧，提取，抗氧化活性

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科植物，又名木粟、分光草，在我國大部分地區(qū)均有栽培，是一種傳統(tǒng)的藥材，可清脾胃，利大小腸，下膀胱結(jié)石，益于五臟，輕身健體；全草提取物能抑制結(jié)核桿菌的生成［1］。該植物含有豐富的酚類化合物［2］，研究其生物活性成分，進(jìn)行深加工，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值及現(xiàn)實(shí)意義。本文研究了從紫花苜蓿中提取單寧的工藝，以期篩選出較好的提取方法，并采用鄰苯三酚自氧化體系、Feton體系對(duì)紫花苜蓿提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，測(cè)定其抗氧化活性，其結(jié)果為紫花苜蓿提取物應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花苜蓿 采自新疆阿勒泰地區(qū)，去雜洗凈后，置于恒溫干燥箱中，60℃烘干，搗碎至60目備用；石油醚 30～60℃沸程；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、無水碳酸鈉、鎢酸鈉、磷鉬酸、無水乙醇、單寧酸（C76H52O46）均為分析純；水 自制新鮮蒸餾水；Folin-Denis顯色劑 50g鎢酸鈉，10g磷鉬酸，加入375mL蒸餾水溶解，再加入25mL 85%的磷酸，水浴回流2h，冷卻后定容至500mL棕色瓶中保存待用。

UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋 北京泰克儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pHS-10B型酸度計(jì) 蕭山市分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫花苜蓿中單寧的提取 準(zhǔn)確稱取烘干并粉碎的紫花苜蓿樣品，置于索氏提取器中，加入50mL石油醚（30～60℃）于50℃下回流2h，以除去樣品中脂類化合物，之后揮干樣品中的石油醚。準(zhǔn)確稱取脫脂后的紫花苜蓿樣品10g，加入一定濃度的乙醇溶液，回流提取一定時(shí)間，趁熱過濾，用提取溶劑洗滌濾渣，合并濾液和洗液，得新疆紫花苜蓿單寧提取液。

1.2.2 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取單寧對(duì)照品10.2mg，用水溶解，定量轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，充分搖勻得0.102mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別取單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于6支25mL容量瓶中，分別加入3.0mL Folin-Denis顯色劑，5mL 7%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻放置20min，以未加單寧試劑的混合液作空白，測(cè)定756nm處吸光度值，以單寧濃度c為橫坐標(biāo)，吸光值 A為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)方程 Y= 35.37815x+0.0069，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，線形范圍為：?jiǎn)螌帩舛?.04～12.24mg/mL。

圖1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 提取方法的正交設(shè)計(jì)方案 在實(shí)驗(yàn)中，由于各因素之間相互交叉影響［3］，因此為全面考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)，確定以乙醇濃度、鹽酸濃度、提取時(shí)間、回流溫度四種因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以測(cè)定紫花苜蓿樣品中的單寧含量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.2.4 樣品液的制備和測(cè)定 稱取5g脫脂后的紫花苜蓿粉末放入250mL錐形瓶中，加入一定比例的提取溶劑，置于恒溫水浴鍋中加熱回流，過濾，用提取溶劑洗滌濾渣，合并濾液和洗液，得新疆紫花苜蓿單寧提取液236mL。取此樣品液1mL置于10mL具塞試管中，然后按與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測(cè)定提取液的吸光度，按下式計(jì)算提取量e：

式中：Y-單寧的質(zhì)量濃度，mg/mL；V-原提取液體積，mL；W-提取用紫花苜蓿的質(zhì)量，g；α-稀釋倍數(shù)。

根據(jù)所測(cè)定溶液的吸光度，用曲線方程計(jì)算出Y。

1.2.5 體外抗氧化活性的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法和Feton體系，并與同等條件下VC抗氧化能力進(jìn)行比較。

1.2.5.1 紫花苜蓿提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用［4-5］在25℃的恒溫水浴鍋中，將pH8.2 Tris-HCl緩沖溶液和 2.5mmol/L鄰苯三酚水浴保溫20min，在25mL比色管中，加入5mL pH8.2 Tris-HCl緩沖溶液，1.00mL提取液，3.8mL溶劑，0.2mL 2.5mmol/L鄰苯三酚，搖勻，當(dāng)鄰苯三酚加入一半時(shí)開始計(jì)時(shí)，記下反應(yīng)啟動(dòng)后第60s的A320值，之后每隔30s記錄一次直到反應(yīng)啟動(dòng)后第4.5min。抑制率按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：V空：不含提取液時(shí)鄰苯三酚的自氧化速率；V樣：有提取液時(shí)的反應(yīng)速率。

1.2.5.2 紫花苜蓿提取物對(duì)羥自由基的清除作用［6］

在10mL具塞試管中加入5mL 0.2mmol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液和2mL樣品溶液，混勻后，加入1mL 3%H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃水浴中反應(yīng)60min后，在536nm處測(cè)定其吸光度A值，以同濃度的樣品溶液為對(duì)照品，按下式計(jì)算清除率：

式中：A0為不含樣品，但含有H2O2的吸光度值；A1為以蒸餾水代替H2O2的吸光度值；A2為含樣品的吸光度值。

1.2.5.3 與VC的對(duì)照實(shí)驗(yàn) 按照上述的兩種方法測(cè)定其抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)條件同樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依照表1設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，確定九組不同的實(shí)驗(yàn)組合，分別得到紫花苜蓿中單寧的提取量，見表2。

從表2中的直觀分析可知，四因素對(duì)單寧提取量影響的主次順序?yàn)辂}酸濃度＞乙醇濃度＞回流溫度＞提取時(shí)間，并且最佳的提取工藝條件為：鹽酸濃度2.5%，乙醇濃度70%，提取溫度50℃，回流提取5h，即A2B3C1D2。在最佳的提取工藝條件下，通過測(cè)定得到新疆紫花苜蓿中單寧含量為2.15mg/g。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 體外抗氧化活性

紫花苜蓿乙醇提取物及VC溶液對(duì)超氧陰離子自由基都具有一定的清除能力，且其清除率隨著濃度的增加而提高，但當(dāng)濃度增加到一定值后，清除率不再隨濃度增大而大幅度提高。在Feton體系中，紫花苜蓿提取物對(duì)·OH有較高的清除能力，且略高于相同條件下VC的清除能力，它們的清除能力與濃度有明顯的量效關(guān)系，即隨濃度增加而增加。

圖2 鄰苯三酚自氧化抑制結(jié)果

圖3 對(duì)羥自由基的清除結(jié)果

3 討論

3.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：新疆紫花苜蓿中含有豐富的單寧，在乙醇熱浸提取紫花苜蓿中的單寧時(shí)，鹽酸濃度是影響單寧提取量的關(guān)鍵因素，影響紫花苜蓿中單寧提取量的因素主次順序?yàn)椋蝴}酸濃度＞乙醇濃度＞回流溫度＞提取時(shí)間。確定了紫花苜蓿中單寧的最佳提取工藝條件為：鹽酸濃度2.5%，乙醇濃度70%，提取溫度50℃，回流提取5h。在最佳的提取工藝條件下測(cè)得紫花苜蓿中單寧含量為2.15mg/g。

3.2 樣品中脂類物質(zhì)含量較高，影響吸光度值的測(cè)定，所以樣品在提取前需經(jīng)石油醚或者氯仿脫脂。

3.3 紫花苜蓿中單寧具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對(duì)鄰苯三酚自氧化有好的抑制能力，對(duì)·OH的清除能力高于VC。這表明紫花苜蓿提取物是良好的天然抗氧化劑，具有廣泛的開發(fā)前景和利用價(jià)值，值得綜合利用和加強(qiáng)資源開發(fā)。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊(cè)）［M］.上海：上海人民出版社，1977：1305.

［2］盧成，曾昭海，張濤，等.紫花苜蓿生物活性成分研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2005，22（9）：28-32.

［3］劉育梅，黃維南.正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定羊奶果葉及樹皮的單寧含量［J］.海峽藥學(xué)，2004，16（2）：49-50.

［4］Gurpreet K M，Sarwar A，Zoobi J.Evaluation of antioxidant activity of Cassia siamea flowers［ J］ .Journal of Ethnopharmacology，2006，108：340-348.

［5］弓曉峰，謝明勇，陳奕.黑芝麻與赤芝麻提取物的抗氧化作用比較［J］.食品科學(xué)，2006，27（4）：44-47.

［6］丁利君，周圳輝，林燕如.芒萁中黃酮物質(zhì)的提取及其抗氧化研究［J］.食品科學(xué)，2006，26（8）：77-80.

Study on the optimum extraction and antioxidant activity of tannic acid in Alfalfa

ZHANG Zong-yuan1，ZHANG Ling1，PENG Yang2
（1.Xinjiang Uygur Autonomous Region Product Quality and Inspection in Academe，Urumqi 830002，China；2.Institute of Applied Chemistry，Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

ln order to extract annic acid in Alfalfa，extraction technology of annic acid was studied by orthogonal experiment.Effects of concentration of extracting solution，content of HCl，temperature and time on annic Acid contents were investigated.Optimum extraction conditions were determined as follows：content of HCl was 2.5%，50% ethanol as the solvent，5h immerge extract at 50℃，the extraction yield of the flavonoids could reach 2.15mg/g.ln vitro antioxidative activity of the extract was evaluated by two systems，pyrogallol auto oxidation method and hydroxyl radical system，and compared with VC.The results indicated that annic acid in Alfalfa had restraining effects on pyrogallol autooxidation，and scavenging effects on hydroxyl radical.

Alfalfa；annic acid；extract；antioxidation activity

TS201.1

B

1002-0306（2011）01-0198-03

2009-02-03

張縱圓（1982-），女，碩士研究生，助工，主要從事分析檢驗(yàn)工作。