李 偉，陳華勇，*，張 凱，王永華，楊 博

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510641）

氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定魷魚(yú)油中的膽固醇

李 偉1，陳華勇1，*，張 凱1，王永華2，楊 博1

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510641）

目的：以正三十二烷為內(nèi)標(biāo)物，建立了魷魚(yú)油中膽固醇含量測(cè)定的氣相色譜（GC）分析方法。方法：采用0.5mol/L的氫氧化鉀乙醇溶液在65℃水浴鍋中對(duì)油樣皂化30min，乙醚萃取，毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定魷魚(yú)油中膽固醇，討論并確定了樣品皂化的最佳條件。結(jié)果：利用該方法，膽固醇與雜質(zhì)可以得到較好的分離和準(zhǔn)確的定量。內(nèi)標(biāo)法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.999，測(cè)得膽固醇含量為29.01±0.56mg/g。膽固醇的最低檢出限為2.21ng，加標(biāo)回收率在92.14%～102.45%之間，其RSD＜5%（n=3）。結(jié)論：該法靈敏度高，分離效果好，定量準(zhǔn)確，適用于魷魚(yú)油中膽固醇的含量測(cè)定。

氣相色譜法，膽固醇，內(nèi)標(biāo)法，魷魚(yú)油

膽固醇是一種具脂類性質(zhì)的環(huán)戊烷多氫菲衍生物，不溶于水，易溶于乙醚、石油醚、氯仿等溶劑。它廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，是動(dòng)物組織細(xì)胞不可缺少的重要物質(zhì)，不僅參與形成細(xì)胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料。蝦蟹類養(yǎng)殖中，由于蝦蟹類不能自身合成膽固醇，必須通過(guò)添加富含膽固醇的餌料來(lái)提高蝦蟹養(yǎng)殖的品質(zhì)和產(chǎn)量［1-2］。富含天然膽固醇的魷魚(yú)油是蝦蟹養(yǎng)殖的一種重要的飼料添加劑。魷魚(yú)油中膽固醇的準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)飼料添加劑的工業(yè)化生產(chǎn)有著重要的指導(dǎo)意義。目前，膽固醇的測(cè)定已有諸多報(bào)道，采用的方法有比色法、酶法、氣相色譜法（GC）、液相色譜法和薄層層析法等，涉及的基體有雞蛋、奶茶、餅干、食用油等［3-6］。通常，基體組成及其復(fù)雜程度對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量影響較大。油樣中膽固醇總量的準(zhǔn)確測(cè)定取決于皂化處理?xiàng)l件［7］。因此，本文詳細(xì)探討了皂化液濃度、皂化時(shí)間、皂化溫度及不同萃取劑對(duì)魷魚(yú)油中膽固醇測(cè)定的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)的皂化處理?xiàng)l件，以三十二烷為內(nèi)標(biāo)物建立了膽固醇的氣相色譜分析法，該法快速、靈敏、準(zhǔn)確，測(cè)試結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度＞96%，上海博奧生物科技有限公司；正三十二烷內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品 純度＞97%，美國(guó)Acros Organics公司；無(wú)水乙醇、正己烷、石油醚（重蒸餾，餾分為30～60℃）、氫氧化鉀、氯化鈉 均為分析純。

氣相色譜儀 7890A，帶FID檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Agilent公司；漩渦振蕩器 廣州正一科技公司；離心機(jī)，恒溫水浴鍋，氮吹儀，50mL圓底燒瓶，容量瓶等玻璃儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別準(zhǔn)確稱取100mg和1000mg正三十二烷內(nèi)標(biāo)物于100mL容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，得到1mg/mL和10mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取50mg膽固醇于50mL容量瓶中，用1mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋至刻度，得到1mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2 樣品處理 稱取魷魚(yú)油樣品約 200mg于50mL圓底燒瓶中，加入1mol/L的 KOH乙醇溶液4.0mL及10mg/mL的正三十二烷內(nèi)標(biāo)液0.1mL，振蕩混勻，接上冷凝管，置于65℃水浴中皂化30min（每隔5min振蕩一次）后取出，經(jīng)流水冷卻后，加入10mL乙醚，旋渦混勻1min，加入3mL飽和食鹽水，旋渦混勻1min。取上層乙醚萃取液1.5mL于2mL離心管中，加入少量無(wú)水硫酸鈉，旋渦混勻1min，離心分離。取上清約1mL，按選定色譜條件進(jìn)樣分析，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.3 分析方法 色譜柱：HP-5毛細(xì)管色譜柱，30m ×0.32mm×0.25μm；載氣：氮?dú)?；柱流速?mL/min（恒流）；氫氣：30mL/min；空氣：350mL/min；尾吹氣：20mL/min；柱溫：200℃保持1min，以10℃/min升到300℃，保持3min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測(cè)器溫度：300℃；分流比：20∶1；進(jìn)樣量：1μL。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 考察不同萃取劑、溫度、時(shí)間、KOH乙醇液濃度對(duì)魷魚(yú)油中膽固醇總量測(cè)定的影響。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，確定油樣最優(yōu)處理?xiàng)l件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 GC分離

取1.2.1中1mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液1mL，按1.2.2中樣品處理方法處理，并用上述GC條件進(jìn)行分析，膽固醇與內(nèi)標(biāo)正三十二烷的分離結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，膽固醇先于正三十二烷出峰，二者保留時(shí)間接近，且能達(dá)到基線分離。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件

2.2.1 萃取劑的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道能有效萃取膽固醇的常見(jiàn)溶劑有正己烷、石油醚和乙醚［3-4］。本文以魷魚(yú)油樣品皂化后膽固醇的檢出量作為指標(biāo)，對(duì)以上三種萃取劑進(jìn)行了對(duì)比。在1.2.2的處理?xiàng)l件下，測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，對(duì)于魷魚(yú)油樣品，3種萃取劑對(duì)膽固醇的提取效果差異不大，其中乙醚的提取效果最佳，石油醚略大于正己烷。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖

表2 膽固醇提取效率的比較

2.2.2 皂化條件的優(yōu)化 魷魚(yú)油中膽固醇通常以游離態(tài)和膽固醇酯兩種形式存在，油樣皂化完全與否將直接影響膽固醇總量的測(cè)定［7］。通常，皂化效果與堿液濃度、皂化時(shí)間和皂化溫度有關(guān)。本文以乙醚為萃取劑，單因素實(shí)驗(yàn)考察了不同皂化溫度、皂化時(shí)間以及KOH乙醇液濃度對(duì)膽固醇總量測(cè)定的影響。

在1mol/L的KOH乙醇液，皂化時(shí)間60min時(shí)，考察了不同溫度（50、65、80、95℃）對(duì)膽固醇總量測(cè)定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，不同溫度對(duì)膽固醇測(cè)定值影響較大，65℃時(shí)測(cè)定的膽固醇含量最高。皂化本身為水解反應(yīng)，從化學(xué)熱力學(xué)的角度來(lái)看，該反應(yīng)為放熱反應(yīng)，溫度太高將不利于反應(yīng)的進(jìn)行，溫度太低則會(huì)降低反應(yīng)速率。

圖2 不同溫度對(duì)皂化的影響

在1mol/L的KOH乙醇液，皂化溫度為65℃時(shí)，考察了不同時(shí)間（5、15、30、45、60min）對(duì)膽固醇總量測(cè)定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖3可以看出，皂化時(shí)間在30～45min左右，膽固醇測(cè)定值可達(dá)到最高。

圖3 不同時(shí)間對(duì)皂化的影響

在皂化溫度65℃，時(shí)間30min時(shí)，考察了不同KOH乙醇液濃度（0、0.1、0.5、1、2mol/L）對(duì)膽固醇總量測(cè)定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，KOH乙醇液濃度在0.1～0.5mol/L時(shí)，膽固醇測(cè)定值較高，KOH濃度增大，膽固醇測(cè)定值降低。這可能是由于高濃度的KOH乙醇液時(shí)生成的鉀皂較多，并形成膠束包裹了一定含量的膽固醇。

圖4 不同KOH濃度對(duì)皂化的影響

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，RA＞RD＞RC＞RB，皂化溫度對(duì)油樣中膽固醇得率影響最大，其次是萃取劑和KOH乙醇液濃度，皂化時(shí)間對(duì)油樣中膽固醇得率影響最小，最佳條件為：0.5mol/L KOH乙醇液，65℃水浴中皂化30min，乙醚為萃取劑，該結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)基本吻合。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢測(cè)限

將1.2.1中膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液用1mg/mL的內(nèi)標(biāo)液稀釋成一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL。各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液均取1mL，通氮?dú)饬鞔蹈?，然后?.2.2中樣品處理方法處理，進(jìn)GC檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積比為縱坐標(biāo)，制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，當(dāng)膽固醇濃度在0.1～1mg/mL范圍內(nèi)，其線性回歸方程Y=0.569X-0.0059，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。按信噪比為3計(jì)算檢出限，該方法膽固醇的最低檢出限為2.21ng。

2.4 方法精密度研究

稱取魷魚(yú)油6份（每份約200mg），每份樣品加入0.1mL的10mg/mL內(nèi)標(biāo)液，按2.2.3得到的最優(yōu)方法處理，膽固醇的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，最優(yōu)條件下膽固醇的含量為29.01±0.56mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.93%（n=6）。

圖5 膽固醇檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表4 方法精密度研究

表5 方法添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 方法添加回收率

本實(shí)驗(yàn)在魷魚(yú)油樣品中加入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液，設(shè)置10、15、20mg/g三個(gè)濃度的添加水平。按2.2.3的最優(yōu)方法處理，先測(cè)定樣品中膽固醇的本底含量，再分別測(cè)定添加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)后，樣品中膽固醇的含量，并計(jì)算添加回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5中可以得知，方法添加回收率在89%～110%之間，說(shuō)明方法具有較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

魷魚(yú)油中膽固醇通常以游離態(tài)和膽固醇酯兩種形成存在，油樣皂化完全與否將直接影響膽固醇總量的測(cè)定。本文從單因素條件分別考察了萃取劑、KOH乙醇液濃度、皂化時(shí)間和溫度對(duì)膽固醇總量測(cè)定的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了最優(yōu)的油樣處理?xiàng)l件；此外，還建立了以正三十二烷為內(nèi)標(biāo)物的膽固醇GC/FID分析方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確。在最優(yōu)條件下：采用乙醚為萃取液、0.5mol/L KOH乙醇液、皂化溫度65℃、皂化時(shí)間30min時(shí)，測(cè)定的膽固醇總量為29.01±0.56mg/g。

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Determination of cholesterol in liquid oil by gas chromatography

LI Wei1，CHENG Hua-yong1，*，ZHANG Kai1，WANG Yong-hua2，YANG Bo1
（1.School of Biological Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China）

Objective：Using dotriacontane as the internal standard，to establish an internal standard method for cholesterol determination in squid oil by gas chromatography（GC）.Method：The oil sample was saponified with 0.5mol/L alcoholic KOH，65℃ water bath heating，30min，then extracted with ether.The impact caused by the different saponification conditions on the determination of cholesterol was studied.ln addition，the best saponification conditions were chosen by orthogonal experiments.Results：The experimental results showed a good linear relation（R=0.9992），the total cholesterol content of squid oil was 29.01±0.56mg/g.The detection limit of the method was 2.21ng，The recoveries of cholesterol were 92.14%～102.45%，RSD＜5%（n=3）.Conclusion：The method of determination of cholesterol in squid oil by GC had high sensitivity，good separation and quantitative accuracy.

GC；cholesterol；internal standard；squid oil

TS225.2+4

A

1002-0306（2011）01-0284-04

2009-11-30 *通訊聯(lián)系人

李偉（1985-），男，碩士研究生，主要從事色譜分析和酶工程方面的研究。

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（G02B2061700）資助。