于 平 陳益潤

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310035)

響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶

于 平 陳益潤

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310035)

對實驗室自行分離得到的芽孢桿菌ZJ0702發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高植酸酶的產(chǎn)量。利用2－level Factorial試驗篩選出對產(chǎn)酶顯著影響的3個因素，通過最陡爬坡試驗確定中心點，再采用Central Composite設(shè)計對重要因子進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)麩皮、蛋白胨和KH2PO4的添加量是影響植酸酶產(chǎn)量的顯著因素，經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為3．7%麩皮，2．27%蛋白胨，0．5%硝酸銨，0．008 63%無機(jī)磷，0．2%CaCl2，0．05%KCl，0．03%MgSO4，0．003%FeSO4，0．003%MnSO4，0．03%NaCl;培養(yǎng)條件為:34 ℃，接種量 7%，pH 7．0，搖瓶裝液量75 mL/250 mL，在上述條件下該芽孢桿菌84 h產(chǎn)酶達(dá)到最高值13 625．8 U/mL，與優(yōu)化前菌株產(chǎn)酶活力相比，酶活提高了19．6%。

芽孢桿菌 植酸酶 優(yōu)化 響應(yīng)面法

植酸是一類六磷酸肌醇物質(zhì)，是谷物、豆類和油料作物籽實中磷和肌醇的主要貯存形式。由于單胃動物(豬、家禽和魚等)缺乏內(nèi)源型的植酸酶系統(tǒng)，因此不能代謝谷物、豆科植物和油料作物飼料中富含的植酸及植酸鹽，造成了磷資源的浪費，對環(huán)境產(chǎn)生了污染，并且作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，其具有極強(qiáng)的螯合能力，可與多種礦物質(zhì)鈣、鎂、鐵、鋅等螯合，形成不溶性復(fù)合物，使一些消化酶、蛋白酶、淀粉酶和胰蛋白酶的作用受到抑制，降低了蛋白質(zhì)、淀粉、脂類物質(zhì)的消化利用，使多種微量元素和氨基酸的利用率下降，因此在飼料中添加植酸酶，可有效提高動物對磷的利用率，減少磷對環(huán)境的污染，并解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料及食品中礦物質(zhì)元素及蛋白質(zhì)的利用率［1－6］。

芽孢桿菌類植酸酶，不僅具有較好的耐熱性，可有效抵御飼料制粒膨化過程中高溫引起的酶失活，而且最適pH在6．5～7．5之間，可適用于一些消化道呈中性的鯉科魚類，并且其在單胃動物的腸道中也表現(xiàn)出酶活力［4］。目前文獻(xiàn)報道的已分離到的產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌產(chǎn)酶普遍較低，達(dá)不到預(yù)期可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)的效果［1－6］，因此提高芽孢桿菌類植酸酶的產(chǎn)量是其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。

本研究以實驗室自行分離得到的芽孢桿菌ZJ0702菌株為研究對象，對其培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進(jìn)行2－level Factorial試驗，篩選顯著因子，再通過響應(yīng)面試驗組合設(shè)計，逼近最大響應(yīng)區(qū)間，擬合出數(shù)學(xué)模型方程，找出最優(yōu)的條件組合，并對其結(jié)果進(jìn)行評估與預(yù)測。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 菌種

本實驗室自行分離，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬中的Bacillus nealsonii，命名為 ZJ0702。

1．1．2 主要試劑和儀器

Tris:上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖:上海生工生物工程有限公司;植酸鈉:Sigma公司;酵母提取物、胰蛋白胨:OXOID公司;其他試劑均為分析純。

磷酸二氫鉀:純度99%，成都東金化學(xué)試劑有限公司。

360型生化培養(yǎng)箱:濰坊醫(yī)療機(jī)械廠;SWCJ1F型超凈工作臺:蘇州凈化設(shè)備廠;2K15型高速低溫離心機(jī):Sigma公司;G－25 KC型恒溫?fù)u床:美國NBS公司;FE20數(shù)顯pH計:METTLER公司;UV－2550紫外可見光分光光度計:SHIMADZU公司。

1．1．3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:1%蛋白胨，0．3%牛肉膏，0．5%NaCl，1．5%瓊脂，pH 7．0。

種子培養(yǎng)基:1%蛋白胨，1%葡萄糖，0．3%牛肉膏，0．5%NaCl，pH 7．0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:3．5%麩皮，2%蛋白胨，0．5%NH4NO3，0．2%CaCl2，0．05%KCl，0．05%MgSO4·7H2O，0．01%KH2PO4，pH 7．0。

1．2 試驗方法

1．2．1 種子培養(yǎng)

將甘油保存的菌株活化后，接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量50 mL/250 mL，溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時間24 h。

1．2．2 搖床發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)基中的菌液以8%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件:搖瓶裝液量 50 mL/250 mL，溫度34℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時間72 h。

1．2．3 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以干燥磷酸二氫鉀作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照崔富昌［7］的方法，制作定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．4 偏釩酸銨法酶活測定

取發(fā)酵液10 mL，4 000 r/min離心15 min去菌體，10 倍稀釋，取0．1 mL 稀釋液 +1．9 mL Tris－HCl(pH 7．5)+4 mL植酸鈉(2 mmol/L)，55℃ 反應(yīng)30 min，再加入4 mL反應(yīng)終止液(100 g/L鉬酸銨250 mL+2．35 g/L釩酸銨250 mL+65%純硝酸165 mL，用水補(bǔ)充至1 000 mL)，顯色10 min，4 000 r/min離心10 min后，于415 nm處測OD值，再根據(jù)定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活?？瞻讓φ諡橄燃臃磻?yīng)終止液，再加反應(yīng)底物。酶活單位(U/mL):在55℃，pH 7．5的條件下，每分鐘從濃度為2 mmol/L的底物植酸鈉中釋放出1 nmol的無機(jī)磷所需要的酶量為1個酶活單位。

1．2．5 2 －level Factorial試驗設(shè)計

根據(jù)前期試驗的結(jié)果，選取了培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件共10個影響因子作為獨立考察的因素，利用Design Expert software軟件設(shè)計2－level Factorial(兩水平部分因子分析)，加入4個用于誤差分析的中心點。

1．2．6 最陡爬坡試驗

根據(jù)2－level Factorial試驗設(shè)計確定的顯著因子設(shè)計最陡爬坡試驗，確定試驗中心點。

1．2．7 響應(yīng)面設(shè)計

以2－level Factorial試驗確定的顯著因子為變量及最陡爬坡試驗確定的中心點，根據(jù)Central Composite的設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面分析試驗。

1．2．8 驗證試驗

以響應(yīng)面設(shè)計得到的結(jié)果進(jìn)行驗證試驗，平行3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2．1 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取干燥的磷酸二氫鉀0．439 g(含磷100 mg)，定容至100 mL，即含磷1 mg/mL，再由其稀釋得到所需濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照崔富昌［7］方法制作定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，磷含量與其光密度值呈線性函數(shù)關(guān)系，其函數(shù)關(guān)系式為 y=0．009 1x－0．017，其中y表示OD值，x表示磷含量，R2為0．99 6，表明線性關(guān)系良好，可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．2 2－level Factorial試驗設(shè)計結(jié)果

各因素規(guī)范值與實際值的設(shè)定水平如表1所示。試驗結(jié)果如表2所示，利用Design Expert software軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示，由此可得顯著因子為麩皮、蛋白胨和無機(jī)磷的添加量。

表1 部分因子分析試驗各因素水平設(shè)計

表2 2－level Factorial試驗設(shè)計與響應(yīng)值表

表3 2－level Factorial試驗設(shè)計與響應(yīng)值表

2．3 最陡爬坡試驗設(shè)計

由2－level Factorial試驗設(shè)計，選取麩皮，蛋白胨和無機(jī)磷3個顯著性因子進(jìn)行最陡爬坡試驗，由表3可知，硝酸銨、接種量和裝液量為正效應(yīng)，故選擇較高水平，CaCl2、MgSO4、溫度、pH 為負(fù)效應(yīng)，故選擇較低水平，以麩皮，蛋白胨和無機(jī)磷3因素0水平添加量(添加量)為 3．5%，2%，0．01%為原點，上下波動確定其試驗中心點，其中麩皮，蛋白胨為正效應(yīng)，設(shè)計逐步增加，而無機(jī)磷為負(fù)效應(yīng)，設(shè)計逐步遞減，試驗設(shè)計與結(jié)果如表4所示。當(dāng)條件為:麩皮3．5%，蛋白胨 2%，無機(jī)磷 0．01% 時，酶活達(dá)到11 589．7 U/mL的最高值，故確定其為中心點。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

2．4 響應(yīng)面設(shè)計

響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法，本試驗采用響應(yīng)面分析方法中的Central Composite試驗設(shè)計，根據(jù)其原理，以植酸酶活為響應(yīng)值設(shè)計3因子5水平20個試驗點的分析試驗，其中14個為析因點，6個用于評估誤差的中心點。因素水平設(shè)計如表5所示，結(jié)果如表6所示。

表5 Central Composite試驗各因素水平設(shè)計

表6 Central Composite試驗設(shè)計與響應(yīng)值表

利用Design Expert software軟件對表6的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果如表7所示。

用Design－expert 7．0對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析及方差分析，擬合得到回歸方程:Y=0．98+0．075A+0．15B － 0．070C － 0．40AB+0．020AC － 0．034BC －0．12A2－0．14B2－0．12C2。從表 7 可以看出，回歸方程因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0．991 6)，方程的“P ＞ F”=0．000 1 ＜0．05，說明此回歸方程顯著;失擬項“Prob＞F”=0．292 7＞0．05，說明方程對試驗的擬合度較好，此試驗方法可靠。

表7 Central Composite試驗設(shè)計與響應(yīng)值表

圖2為三維響應(yīng)面圖及等高線圖，可知產(chǎn)酶存在最高點，對回歸方程求極值，可得A=3．7%，B=2．27%，C=0．008 63%，即麩皮含量為 3．7%，蛋白胨含量為2．27%，無機(jī)磷含量為0．008 63%，此時植酸酶活力最高，為12 749．8 U/mL，在此條件下進(jìn)行了3次平行驗證試驗，植酸酶平均酶活為12 726．1 U/mL，與理論值基本相符，這說明回歸方程能較真實地反應(yīng)各因素對植酸酶表達(dá)量的影響。

圖2 各因子對植酸酶酶活交互影響效應(yīng)響應(yīng)面立體分析圖及其等高線圖

2．5 響應(yīng)面優(yōu)化前后產(chǎn)酶曲線對比

使用優(yōu)化前的培養(yǎng)條件與進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化后的條件分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，每12 h測定植酸酶活力，繪制產(chǎn)酶曲線進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的產(chǎn)酶曲線的最高產(chǎn)酶值明顯要高于響應(yīng)面優(yōu)化前的產(chǎn)酶曲線，而且培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后，延長了產(chǎn)酶時間，優(yōu)化前72 h時便達(dá)到了產(chǎn)酶的最高值，而優(yōu)化后則在84 h時達(dá)到最高值，達(dá)到了13 625．8 U/mL，說明培養(yǎng)基經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化后對產(chǎn)酶的提高及發(fā)酵時間的延長效果顯著(如圖3所示)。

圖3 優(yōu)化前后產(chǎn)酶曲線的比較

3 結(jié)論

應(yīng)用2－level Factorial試驗設(shè)計和Central Composite試驗設(shè)計方法組合優(yōu)化芽胞桿菌產(chǎn)植酸酶培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件。經(jīng)優(yōu)化后確定培養(yǎng)基配方為:3．7%麩皮，2．27% 蛋白胨，0．5% 硝酸銨，0．008 63%無機(jī)磷，0．2%CaCl2，0．05%KCl，0．03%MgSO4，0．003%FeSO4，0．003%MnSO4，0．03%NaCl，培養(yǎng)條件為:34 ℃，接種量7%，pH 7．0，裝液量75 mL，產(chǎn)酶可達(dá)13 625．8 U/mL，對比優(yōu)化前菌株產(chǎn)酶活力11 388．4 U/mL，酶活提高了19．6%。由此可知響應(yīng)面分析法優(yōu)化微生物發(fā)酵條件是一種十分有效的方法。

志謝:感謝浙江省“新世紀(jì)151人才工程”的大力支持。

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Application of Response Surface Methodology to Optimize the Fermentation Conditions for Producing Phytase from Bacillus subtilis

Yu Ping Chen Yirun

(College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035)

The fermentation conditions for producing phytase by Bacillus subtilis ZJ0702 were optimized in order to enhance its activity．Three factors influencing phytase activity significantly were screened by 2 － level factorial experiment，the central point was determined by the steepest ascent experiment and the optimal fermentation conditions were established by central composite design．The results indicated that wheat bran，tryptone and KH2PO4were the three main factors which have an obvious effect on the phytase activity．The optimal fermentation medium components were:wheat bran 3．7%，tryptone 2．27%，KH2PO40．008 63%，NH4NO30．5%，CaCl20．2%，KCl 0．05%，MgSO40．03%，F(xiàn)eSO40．003%，MnSO40．003%，NaCl 0．03%;the optimal enzyme －producing conditions were:34 ℃，inoculum volume 7%，pH 7．0，liquid volume in flask 75 mL/250 mL．Under these conditions，phytase activity was up to 13 625．8 U/mL after Bacillus subtilis was cultured for 84 h，which was 19．6%higher comparing with that before optimization．

Bacillus subtilis，phytase，optimizing，response surface

Q81

A

1003－0174(2011)03－0086－05

浙江省教育廳重點研究項目(Z201010029)

2010－04－15

于平，男，1974年出生，博士，教授，食品生物技術(shù)