單曉楓，吳同壘，孟慶峰，王偉利，錢愛東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;2.吉林進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局，長(zhǎng)春 130062)

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii，AV)隸屬于氣單胞菌屬，是一種新型的人-獸-魚共患病原菌。其不僅可以引發(fā)人的胃腸炎、腦膜炎、腹膜炎、敗血癥和外傷感染等［1-3］，還對(duì)魚蝦蟹等多種水生動(dòng)物具有較強(qiáng)的致病力［4-7］。維氏氣單胞菌可產(chǎn)生多種毒力因子，如氣溶素、溶血素、外膜蛋白、粘附素和胞外蛋白酶等。其中，外膜蛋白可增強(qiáng)細(xì)菌的粘附作用，維持外膜結(jié)構(gòu)、抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺傷力等，是一種重要的毒力因子;此外，外膜蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，還可以用外膜蛋白建立特異性強(qiáng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)維氏氣單胞菌的研究處于起步階段，尚未見AV外膜蛋白的研究報(bào)道，為此，本試驗(yàn)以AV基因組DNA中克隆了OMPAⅠ基因，并對(duì)其序列進(jìn)行Blast比對(duì)，用生物信息學(xué)軟件對(duì)其編碼蛋白的理化參數(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位等進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為維氏氣單胞菌基因工程疫苗的研發(fā)和特異性免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 維氏氣單胞菌CY0806，分離自吉林某漁場(chǎng)養(yǎng)殖患病框鏡鯉，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定［8］;大腸桿菌DH5α，由本實(shí)驗(yàn)室保存制備。

1.2 主要試劑 DL2000 Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;氣單胞菌培養(yǎng)基RS購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的AV OMPAⅠ基因序列，用生物軟件 Primer Premer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物:P1:5'-GACGATATCATGATGAAAATGGCTCCT-3'，P2:5'-GCGAAGCTTTTACTTCTGAACTTCTTG-3'。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 目的基因的PCR擴(kuò)增 以AV CY0806細(xì)菌基因組DNA為模板，以P1、P2為上下游引物，反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，59 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，共34個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠分析后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.5 目的基因的克隆與鑒定 將回收產(chǎn)物于pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，涂布于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12-16 h，挑取單個(gè)菌落、液體LB中增菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送至寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

1.6 目的基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用 NCBI、DNAstar、MEGA4.0 等分子生物學(xué)軟件或網(wǎng)站，對(duì)目的基因及編碼蛋白進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 OMPAⅠ基因的克隆 以 CY0806基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出與目的基因大小相符的條帶(圖1)。將擴(kuò)增的OMPAⅠ基因片段純化后，與pMD18-T載體連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定證實(shí)目的基因已成功克隆與載體中。

圖1 AV CY0806株OMPAⅠ基因的PCR擴(kuò)增

2.2 OMPAⅠ基因的序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹 經(jīng)序列測(cè)定，OMPAⅠ基因全長(zhǎng)1026 bp，編碼338個(gè)氨基酸。利用Blastn對(duì)獲得的OMPAⅠ基因序列進(jìn)行同源性分析:該基因與維氏氣單胞菌AB2902300的OMPAⅠ基因同源性為93%，與其他氣單胞菌同源性大于80%，與不同菌種的OMPAⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示。

圖2 AV CY0806株OMPAⅠ基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 OMPAⅠ基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 OMPAⅠ的分子特征 經(jīng)ProtParam tool和DNAStar分析，OMPAⅠ分子量 36044.6 u，推測(cè)分子式C1602H2488N466O485S9，含有32個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K，R)，31 個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D，E)，130 個(gè)疏水氨基酸(A，I，L，F(xiàn)，W，V)，80 個(gè)極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)，等電點(diǎn)7.82，半衰期為 30 h(體外哺乳動(dòng)物類網(wǎng)狀細(xì)胞)、大于20 h(在酵母體內(nèi))及10 h(在大腸桿菌體內(nèi))，不穩(wěn)定性系數(shù)25.78，屬于穩(wěn)定蛋白，平均疏水值-0.189。

2.3.2 OMPAⅠ信號(hào)肽與轉(zhuǎn)膜區(qū)分析 通過SignaIP軟件分析:OMPAⅠ蛋白序列最前端的23個(gè)N-末端氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，最佳切割位點(diǎn)為23-24個(gè)氨基酸(圖3);在線軟件TMHMM分析結(jié)果顯示:OMPAⅠ蛋白無跨膜區(qū)。

圖3 AV CY0806株OMPAⅠ蛋白分子信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4 AV CY0806株OMPAⅠ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.3 OMPAⅠ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 以Gamier-Bobson方法預(yù)測(cè)OMPAⅠ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):α螺旋占41.5%，β折疊占39.5%，β轉(zhuǎn)角占6.34%，無規(guī)卷曲占 12.6%;而通過 Chou-Aasman方法分析發(fā)現(xiàn)α螺旋占38.9%，β折疊占16.7%，β 轉(zhuǎn)角占36.3%(圖 4)。

2.3.4 OMPAⅠ蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 綜合Kyte-Doolittle標(biāo)準(zhǔn)對(duì)OMPAⅠ蛋白親水區(qū)的預(yù)測(cè)、Emini原則對(duì)OMPAⅠ蛋白的表面暴露區(qū)的分析、Karplus-sohulz預(yù)測(cè)方案對(duì)OMPAⅠ蛋白柔性區(qū)域的預(yù)測(cè)、Chou-Aasman方案對(duì)OMPAⅠ蛋白的β轉(zhuǎn)角分析等結(jié)果預(yù)測(cè)OMPAⅠ蛋白可能B細(xì)胞抗原表位位于(圖5所示):78-80(Thr，Gly，Arg)、87-91(Arg，Thr，Glu，Ser，Gln)、126-128(Ser，Asp，Thr)、164-165(Asn，Gly)、171(Asn)、225-226(Asp，Thr)、247-250(Pro，Lys，Asp，Gly)、259-260(Asp，Arg)、264-265(Asp，Ala)、301-302(Gln，Pro)、334-337(Gly，Arg，Asn，Lys)。

圖5 蛋白親水性、柔韌性、表面暴露區(qū)和抗原指數(shù)分析

3 討論

維氏氣單胞菌廣泛分布于水、土壤等環(huán)境中，可感染人類并引發(fā)多種疾病。近年來，其致水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道也屢有發(fā)生。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)維氏氣單胞菌的研究相對(duì)較少，而有關(guān)毒力因子的研究則未見報(bào)道。其中，外膜蛋白作為革蘭氏陰性菌外膜中的重要蛋白成分，具有較強(qiáng)的免疫原性，且種類、數(shù)量也隨菌株的不同而有所差異。在國(guó)外，已有報(bào)道利用外膜蛋白建立的間接ELISA方法檢測(cè)維氏氣單胞菌，結(jié)果表明該檢測(cè)方法行之有效［9］;Vazquez-Juarez［10］以維氏氣單胞菌外膜蛋白做基因工程疫苗，對(duì)斑帶副鱸進(jìn)行了免疫同時(shí)進(jìn)行了保護(hù)力試驗(yàn)，結(jié)果表明維氏氣單胞菌的外膜蛋白具有較高的免疫原性。本試驗(yàn)針對(duì)維氏氣單胞菌OMPAⅠ吉亞尼設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)維氏氣單胞菌吉林分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與目的基因大小一致的基因片段，經(jīng)序列分析，該基因序列與GenBank登錄的維氏氣單胞菌菌株AB2902300的OMPAⅠ同源性為93%，與其他氣單胞菌同源性大于80%，說明氣單胞菌屬間的OMPAⅠ有較高的同源性，但仍存在一定的種屬差異。

研究應(yīng)用SignalP軟件對(duì)維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白的信號(hào)肽位置及最佳切割位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。而信號(hào)肽的作用是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌，當(dāng)前體蛋白已正確定位，切除信號(hào)肽，同時(shí)蛋白立體構(gòu)象發(fā)生改變，前體蛋白變成成熟的蛋白質(zhì)。因此，預(yù)測(cè)分析信號(hào)肽為維氏氣單胞菌OMPAⅠ蛋白的異源表達(dá)等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

為了提高預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，研究者往往采用不同的方法進(jìn)行分析。本研究以二種方法預(yù)測(cè)分析了維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)表明:該蛋白α螺旋的含量相對(duì)較高，而α螺旋與β折疊由于有氫鍵的維持使蛋白不易變形，可以穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)［11］。因此，通過預(yù)測(cè)分析，維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。

目前，B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)一般綜合多種參數(shù)進(jìn)行分析，以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究以親水性、柔韌性、表面可能性以及β轉(zhuǎn)角等預(yù)測(cè)方案綜合考慮。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果該蛋白可能有11處區(qū)域?yàn)锽細(xì)胞表位，但若要證實(shí)仍需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。一經(jīng)證實(shí)，可利用合成肽等技術(shù)合成維氏氣單胞菌CY0806株OMPAⅠ蛋白的特異性B細(xì)胞表位的短肽，為制備維氏氣單胞菌的特異性抗體、建立檢測(cè)維氏氣單胞菌的特異性診斷方法奠定基礎(chǔ)。

［1］Wang J T，F(xiàn)ang C T，Hsueh P R，et al.Spontaneous Bacterial Empyema Caused by Aeromonas veronii Biotype Sobria［J］.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2000，37:271-273.

［2］Shiina Y，Ii K，Iwanaga M.An Aeromonas veronii Biovar Sobria Infection with Disseminated Intravascular Gas Production［J］.Infect Chemother，2004，10:37-41.

［3］Figueras M J，Aldea M J，F(xiàn)ernández N，et al.Aeromonas Hemolytic Uremic Syndrome.A Case and a Review of the Literature［J］.Diagnostic Microbiologyand Infectious Disease，2007，58:231-234.

［4］Rahman M，Colque-Navarro P，Khn I，et al.Identification and Characterization of Pathogenic Aeromonas veronii Biovar Sobria Associated with Epizootic Ulcerative Syndrome in Fish in Bangladesh［J］.Applied Environmental Microbiology，2002，68(2):650-655.

［5］Sung H H，Hwang S F，Tasi F M.Responses of Giant Freshwater Prawn(Macrobrachium rosenbergii)to Chall- enge by Two Strains of Aeromonas spp.［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2000，76:278-284.

［6］房 海，陳翠珍，張曉君，等.中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗(yàn)［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(1):45-49.

［7］潘曉藝，沈錦玉，李建應(yīng)，等.青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(10):1571-1576.

［8］龔 倩，高淑琴，單曉楓，等.框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(12):981-983.

［9］Arora S，Agarwal R K，Bist B.Comparison of ELISA and PCR vis-a`-vis Cultural Methods for Detecting Aeromonas spp.in Foods of Animal Origin［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，106:177-183.

［10］ Vazquez-Juarez R C，Gomez-Chiarri M，Barrera-Saldana H，et al.Evaluation of DNA Vaccination of Spotted Sand Bass(Paralabrax Maculatofasciatus)with Two Major Outer-Membrane Protein-Encoding Genes from Aeromonas veronii［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2005，19:153-163.

［11］ David W M.Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis［M］.Beijing:Science Press，2002.