李 宇,吳 芳,章 樂,張萬江

2.石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832002

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種重要傳染性疾病,是人類健康的主要?dú)⑹?。?jù)WHO統(tǒng)計(jì),全球約有1/3的人感染結(jié)核桿菌,但其中不足1/10的感染者發(fā)展為結(jié)核病,且每年不到0.1%的感染者死于該病[1];這都提示個(gè)體遺傳差異與結(jié)核病易感性相關(guān)[2]。近年來,隨人類基因組流行病學(xué)的發(fā)展,宿主易感基因在結(jié)核病發(fā)生與進(jìn)展中的作用更日益凸顯,并受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注,其中MBL基因就是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

甘露糖結(jié)合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)屬于Ca2+依賴型凝集素家族中的一員,它主要通過調(diào)理作用和激活補(bǔ)體途徑而發(fā)揮天然免疫防御功能。MBL天然免疫功能的發(fā)揮依賴于其充足的血清濃度和完整的多聚結(jié)構(gòu)。已有研究證實(shí),MBL血清濃度低下或結(jié)構(gòu)缺損受MBL基因的6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的影響,這其中包括位于啟動(dòng)子區(qū)—550位的H/L,—221位的X/Y和+4位的P/Q以及外顯子1區(qū)的52、54、57,3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。隨著對MBL的免疫防衛(wèi)功能的逐步深入了解和結(jié)核病免疫機(jī)制的不斷闡明,人們對MBL基因與肺結(jié)核發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)研究也取得了進(jìn)一步突破。本研究采用病例-對照研究方法,應(yīng)用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)技術(shù)對我國新疆漢族結(jié)核病患者和健康對照者M(jìn)BL基因的H/L、P/Q和A/B位點(diǎn)進(jìn)行基因及單倍體分型,并比較其基因型和單倍體型分布頻率,探討MBL基因多態(tài)性與新疆漢族人群結(jié)核病的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 肺結(jié)核病例組 在新疆塔城、石河子、沙灣縣等地區(qū)長期生活的漢族肺結(jié)核患者231例,其中男117例,女114例,年齡23～75歲,平均年齡39.2歲。入選標(biāo)準(zhǔn)為：①所有病例均按照1996年國家制定的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為肺結(jié)核病;②無慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、糖尿病、高血壓等并發(fā)癥;③無遺傳病家族史;④所有病例均排除具有結(jié)核病相似病癥者,同時(shí)排除HIV感染、腫瘤患者、長期使用激素、器官移植等免疫功能低下者;⑤在新疆地區(qū)居住時(shí)間20年以上。

1.1.2 正常對照組 與病例組生活地區(qū)相一致的漢族健康志愿者226例,其中男118例,女108例,年齡25～72歲,平均年齡36.8歲。入選標(biāo)準(zhǔn)為：①經(jīng)胸部X線透視檢查無活動(dòng)性肺結(jié)核病灶、無病理鈣化灶及病理性肺部陰影;②與病例組患者無血緣關(guān)系;③血清結(jié)核抗體檢測陰性;④無慢阻肺、哮喘、肺癌、糖尿病、高血壓等合并癥;⑤無遺傳病家族史和結(jié)核病史;⑥排除各種慢性病史以及接受激素治療引起免疫功能低下者。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶(北京天根生物工程公司)、蛋白酶K(上海生物工程有限責(zé)任公司)、DNTP(北京天根生物工程公司)、MBL引物(上海生物工程有限責(zé)任公司)、瓊脂糖(美國BBI公司)、DNA Marker(上海生物工程有限責(zé)任公司)、飽和酚/氯仿/異戊醇(上海生物工程有限責(zé)任公司)、溴酚藍(lán)(寶生物大連有限公司)、三氯甲烷(天津大茂化學(xué)試劑廠)。

1.3 主要儀器 PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀(美國Bio-metra公司)、Bio—RAD梯度 PCR儀(美國Bio-RAD公司)、DYY-4型電泳儀(北京六一廠)、Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-RAD公司)、凝膠成像儀(美國伯樂公司)、T U-1800紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)、UV—2401PC紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、2-16K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)、XW-80A渦旋振蕩器(上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司)。

1.4 外周血DNA的提取 采用酚-氯仿法提取全血基因組DNA。

1.5 MBL基因各位點(diǎn)的基因型和單倍體分型

1.5.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參照文獻(xiàn),委托上海生物工程有限責(zé)任公司,分別針對MBL基因H/L、P/Q、A/B 3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成5對特異性引物(所選擇的位點(diǎn)、引物序列和引物位置見表1)。

表1 MBL基因分型及單倍體分型所需的特異性及通用引物Table 1 The Primers sequence and size for MBL alleles

1.5.2 MBL基因的 H/L、P/Q和 A/B位點(diǎn)的PCR-SSP分析 正向序列特異性引物Hf/Lf與反向序列特異性引物Pr/Qr,4條引物兩兩配對,共計(jì)4對組合分別對每個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物對PSMB8-1/PSMB8-2作為陽性內(nèi)參照,在有陽性內(nèi)參照出現(xiàn)的情況下根據(jù)產(chǎn)生的特異性條帶判斷H/L、P/Q位點(diǎn)的基因型和單倍體型。其中通用引物對擴(kuò)增的片斷長度為862bp;4對特異性引物的擴(kuò)增的片斷長度分別為662bp。如圖1所示：某個(gè)樣本的Hf/Pr和Lf/Pr引物對擴(kuò)增產(chǎn)物陽性,因此我們可以判斷該樣本上述兩個(gè)位點(diǎn)的基因型分別為H L,PP;單倍體型則為 HP,LP。擴(kuò)增體系為：ddH2O ：14.5μ L;10 ×buffer(Mg2+Plus)：2.5μ L;dNTP(2.5mmol/L)：2.5μ L;PCR Primer：上下游各0.5μ L;TaqDNA Polymerase：0.5μ L;Template DNA ：3.0μ L;HGH Primer：上下游各 0.5μ L;反應(yīng)總量為25μ L。擴(kuò)增條件：96℃預(yù)變性3min;96℃變性30s,62℃高溫退火45s,72℃延伸45s,共計(jì)10個(gè)循環(huán);96℃變性30s,60℃中溫退火 45s,72℃延伸45s,共計(jì)20個(gè)循環(huán);96℃變性45s,58℃低溫退火60s,72℃延伸60s,共計(jì) 5個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。

1.5.3 MBL基因的A/B位點(diǎn)的PCR-SSP分析針對野生型A等位基因引物對是MW-MGF,針對變異型B等位基因引物對為MU-MGR,通用引物對MGF-MGR。在有陽性內(nèi)參照出現(xiàn)的情況下根據(jù)產(chǎn)生的特異性條帶判斷MBL基因的A/B位點(diǎn)的基因型。通用引物對擴(kuò)增的片斷長度為651bp;A等位基因擴(kuò)增的片斷長度為270bp;B等位基因擴(kuò)增的片斷長度為423bp。擴(kuò)增體系同前。擴(kuò)增條件：96℃預(yù)變性 3min;96℃變性 30s,62℃退火 30s,72℃延伸30s,共計(jì)30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。

1.6 分析方法 對所選樣本進(jìn)行Hardy-Weiberg平衡檢驗(yàn),結(jié)果表明兩組資料的MBL各位點(diǎn)的基因型及單倍體型的頻率的觀察值和期望值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說明樣本基因型和單倍體型的頻率分布符合Hardy-weinberg平衡定理,它們在病例組和對照組人群中的分布是均勻的,來自同一個(gè)孟德爾群體,可以進(jìn)行下一步研究。

采用χ2檢驗(yàn)方法分析比較肺結(jié)核病例組與正常對照組人群中等位基因型及單倍體型的分布情況,并計(jì)算OR值及95%的可信區(qū)間。統(tǒng)計(jì)過程使用雙側(cè)檢驗(yàn),P＜0.05有顯著性差異。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。

1.7 測序 選取10%MBL各位點(diǎn)等位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,純化回收后送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié) 果

2.1 MBL各位點(diǎn)的等位基因和單倍體型的頻率分布結(jié)果見表2、3。

表2 MBL基因各位點(diǎn)的等位基因頻率分布表Table 2 Allele locus frequencies of MBL genes

表3 MBL基因各位點(diǎn)的單倍體型頻率分布表Table 3 Haplotypes locus frequencies of MBL genes

2.2 PCR結(jié)果 健康對照組中的MBL基因AA基因型的頻率顯著高于肺結(jié)核病例組,兩組的頻率值分別是82.30%和74.03%,兩者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(χ2=4.576,OR=0.613,P＜0.05);肺結(jié)核病例組中的MBL基因AB基因型的頻率顯著高于健康對照組,兩組的頻率值分別為24.68%和16.37%,兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.821,OR=1.673,P＜0.05)。而在所檢測的MBL基因H/L、P/Q兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因及各單倍體型在兩組間的分布則無顯著性差異(P值均大于0.05)。

2.3 測序結(jié)果 隨機(jī)抽取上述位點(diǎn)的各等位基因型及單倍體型10%的陽性例數(shù),送往上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測序,結(jié)果顯示經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的片段與參考序列的同源性吻合率接近100%。

3 討 論

MBL是天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[3],其主要通過調(diào)理吞噬和活化補(bǔ)體等方式來清除病原體。MBL發(fā)揮免疫防御功能有賴于一定的血清濃度和四級(jí)結(jié)構(gòu)的多聚形式,血清MBL水平低下將導(dǎo)致機(jī)體調(diào)理吞噬功能缺損,而結(jié)構(gòu)缺失將影響MBL發(fā)揮正常的補(bǔ)體活化功能,從而使機(jī)體易患感染[4]。

目前有較多的研究報(bào)道MBL基因多態(tài)性與結(jié)核病的易感性相關(guān)。國外有研究者發(fā)現(xiàn)[5-6],印度人與美國黑人肺結(jié)核病例MBL-54位點(diǎn)基因突變頻率高于對照組;而在美國白種人、西班牙裔人、土耳其人中未發(fā)現(xiàn)MBL基因突變與肺結(jié)核有關(guān)聯(lián)[6-7],甚至發(fā)現(xiàn)MBL-57位點(diǎn)基因突變型為肺結(jié)核的保護(hù)基因[8];Hoal-Van等[9]在南美研究發(fā)現(xiàn)MBL-54位點(diǎn)雜合子突變型與對抗結(jié)核性腦膜炎;另外有研究顯示,在南非黑人當(dāng)中,攜帶MBL的B等位基因的人不易患結(jié)核性腦膜炎和肺結(jié)核;LE Mombo[10]對非洲人群調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)MBL-54、57位點(diǎn)基因突變型與結(jié)核病相關(guān);Cosar[11]則發(fā)現(xiàn) AB基因型和MBL血清低水平有益于抵抗結(jié)核病,特別是對于非洲肺結(jié)核兒童患者而言。國內(nèi)學(xué)者馮福民[12-13]等人研究發(fā)現(xiàn)MBL-52、54位點(diǎn)基因突變型與北方漢族肺結(jié)核發(fā)病有關(guān);而劉瑋博士[14]等人對中國漢族人群的MBL基因H/L、X/Y、P/Q和A/B四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型及單倍體型分析后發(fā)現(xiàn)HL和 LL基因型是結(jié)核病的抵抗基因;并且發(fā)現(xiàn)LPYB、LPXA單倍體型與肺結(jié)核發(fā)病有關(guān)聯(lián)。

本課題采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)技術(shù)對MBL基因H/L、P/Q和A/B三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行基因型和單倍體分型,發(fā)現(xiàn)MBL基因AB基因型可能是新疆漢族人群結(jié)核病的易感基因,這與馮福民文獻(xiàn)報(bào)道的我國北方漢族人群結(jié)核易感等位基因結(jié)論相同,與國外部分文獻(xiàn)報(bào)道的印度人、美國黑人、非洲人群的結(jié)核易感等位基因也一致;但與國外其它有些文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論相悖;而MBL基因AA基因型可能是結(jié)核病的抵抗基因這一結(jié)論迄今為止國內(nèi)外尚未見有關(guān)報(bào)道。這進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)核病MBL基因的相關(guān)等位基因的分布存在人種、民族和地域的差異。

新疆漢族是我國比較特殊的一個(gè)群體,其特殊性在于它來源廣泛。自古以來新疆就經(jīng)歷著各民族的遷徙融合,從西漢時(shí)起,中原漢族人就通過屯墾戍邊的途徑流入新疆。隨著新中國的成立以及屯墾戌邊政策的繼續(xù)推行,全國各地更多的漢族人涌入該區(qū)域;所以我們從理論上可以推測其MBL基因的多態(tài)性融合了不同地區(qū)漢族人的特性,加上新疆地理、氣候、飲食等環(huán)境因素與內(nèi)地相差比較顯著,有可能會(huì)引起久居于此的漢族人群這一整體的MBL基因多態(tài)性結(jié)構(gòu)發(fā)生深刻的變化。而這很可能就是新疆漢族人群為什么是我國結(jié)核病高發(fā)人群的一個(gè)重要原因,也可能是當(dāng)?shù)貪h族人MBL結(jié)核易感基因型獨(dú)特性的原因所在。

雖然本課題研究未發(fā)現(xiàn)MBL基因H/L、P/Q位點(diǎn)的基因型以及其單倍體型與結(jié)核病有關(guān)聯(lián),但僅僅依據(jù)某次研究結(jié)果并不能完全否認(rèn)其與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展有內(nèi)在聯(lián)系的可能。這是因?yàn)椋篗BL基因啟動(dòng)子區(qū)有三個(gè)SNP位點(diǎn),分別為-550位的H/L,-221位的X/Y及+4位的P/Q,研究表明這三個(gè)位點(diǎn)并不獨(dú)立,而是以一定形式的單倍體型存在,因此如果想探討MBL基因多態(tài)性與結(jié)核病的關(guān)聯(lián),最好要對三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單倍體型檢測,缺乏其中任何一個(gè)位點(diǎn)的研究都不會(huì)具備充足的意義。據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)我國漢族人群外顯子區(qū)僅有54位點(diǎn)突變,如果可以同時(shí)聯(lián)合考察MBL基因結(jié)構(gòu)區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)在研究人群的連鎖不平衡模式并進(jìn)行單倍體型分析,或許更有助于找出與結(jié)核病相關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記[15]。

由于結(jié)核病是多基因遺傳病,個(gè)體對結(jié)核病易感性的差異,可能是由少數(shù)幾個(gè)主效基因(major gene)或多個(gè)微效基因(minor gene)共同決定的[16];因此我們無法單從某個(gè)基因的多態(tài)性角度來完整的解釋其與結(jié)核病易感性之間真正的關(guān)聯(lián);且結(jié)核病的發(fā)病與周圍環(huán)境因素密切相關(guān),這提醒我們在從宿主遺傳角度探討結(jié)核病易感性的時(shí)侯,要注意進(jìn)行主效基因和微效基因間以及基因與特定環(huán)境因素間交互作用的研究。此外,無法排除樣本量的不均和基因分型技術(shù)的不統(tǒng)一造成的研究結(jié)果缺乏可比性。因此,只有全面考察和分析比較結(jié)核病發(fā)病的各個(gè)層面和所有環(huán)節(jié),我們最終才能確切清晰結(jié)核病發(fā)病的相關(guān)機(jī)制,為今后制定完善的防癆和抗癆等醫(yī)療措施奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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