李存芝，歐仕益，周 琪，晏日安，張 寧

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

薏米及發(fā)芽薏米酶解抗氧化活性變化

李存芝，歐仕益，周 琪，晏日安，張 寧

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

采用測(cè)還原力和抗DPPH自由基清除活性這兩種體外實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)薏米經(jīng)中性蛋白酶酶解前后的抗氧化活性進(jìn)行了比較，適宜的酶解條件為：溫度40℃，時(shí)間5h。實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)芽薏米比薏米的抗氧化活性有所提高，而蛋白酶酶解發(fā)芽薏米具有較高的抗氧化活性。將薏米及發(fā)芽薏米進(jìn)行酶解處理，其產(chǎn)物的抗氧化活性由高到低排序?yàn)椋喊l(fā)芽后酶解薏米，酶解薏米，發(fā)芽薏米，原薏米。研究為進(jìn)一步分析研究薏米抗氧化物質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)薏米及發(fā)芽薏米功能食品開發(fā)起到促進(jìn)作用。

薏米，抗氧化，酶解

薏米在我國(guó)一直是很有價(jià)值的藥食兼用保健食品，日本、韓國(guó)及歐美等國(guó)家對(duì)薏米也尤其推崇，每年都從我國(guó)進(jìn)口大量薏米，并且有薏米飲料等相關(guān)產(chǎn)品面世。薏米含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，而且是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有健脾、補(bǔ)肺、消炎、化濕利尿等功效，可減少患癌幾率，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”。薏米的蛋白質(zhì)含量高于大米，專家認(rèn)為其保健功能毫不遜色于冬菇、靈芝［1］。近年來天然抗氧化食品由于特有的保健功能而受到更多的關(guān)注，天然產(chǎn)物抗氧化活性的研究對(duì)食品及醫(yī)藥工業(yè)都具有重要的意義［2-4］。本研究采用測(cè)還原力和抗DPPH自由基清除活性這兩種體外實(shí)驗(yàn)方法，針對(duì)薏米及發(fā)芽薏米經(jīng)過蛋白酶酶解前后抗氧化活性的變化進(jìn)行分析研究，旨在為進(jìn)一步開發(fā)安全綠色的營(yíng)養(yǎng)保健和抗氧化食品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

薏米 市售；中性蛋白酶 廣州裕立寶生物科技有限公司提供；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl） Sigma公司，紫色結(jié)晶；混合磷酸鹽緩沖溶液 pH6.6；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等其他試劑 均為分析純。

HH-4恒溫水浴 江蘇金壇宏華儀器廠；721型分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；HC-2518離心機(jī) 科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薏米、發(fā)芽薏米粉的制備及薏米蛋白酶酶解的工藝路線

1.2.1.1 薏米粉制備 薏米用粉粹機(jī)粉碎，得到薏米粉，40℃烘箱干燥5h，冷藏保存。

1.2.1.2 發(fā)芽薏米粉制備 取浸泡好的薏米于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)26h，然后將發(fā)芽薏米置于50℃的烘箱中干燥24h，粉碎成粉待用。

1.2.1.3 薏米蛋白酶解工藝流程 將薏米粉（或發(fā)芽薏米粉）與適量的0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）混合，配制成濃度為40%的薏米溶液，加入蛋白酶，充分混合，再于一定溫度水浴下振蕩水解。水解結(jié)束后，立即100℃滅活酶。冷卻后4000r/min離心10min，取上清液待測(cè)定。

1.2.2 薏米DPPH自由基清除能力的測(cè)定［6］二苯基苦味肼基自由基［DPPH·］是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，常用來評(píng)估抗氧化物的供氫能力，它在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，乙醇溶液呈紫色，并且在517nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系。當(dāng)遇到自由基清除劑時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)，其顏色變淺。在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值變小，且這種顏色的變淺程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系。因此，可通過測(cè)定吸光值的變化來評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果。

取不同濃度的薏米酶解溶液或未經(jīng)酶解的薏米溶液2mL，加入0.025g/L DPPH甲醇溶液2mL，經(jīng)混合后在室溫下避光反應(yīng)30min，517nm處測(cè)定吸光度Ai；同時(shí)測(cè)定DPPH甲醇溶液（2mL）+甲醇（2mL）的吸光度A0和樣品溶液（2mL）+甲醇（2mL）的吸光度Aj。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率，DPPH自由基清除率越高，即抗氧化活性越高。

1.2.3 薏米還原能力測(cè)定［3，8］還原力的測(cè)定是用來評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的常用方法。還原力強(qiáng)的樣品應(yīng)該是良好的電子供應(yīng)者，它供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原為Fe2+，也可以與自由基反應(yīng)。

取一定濃度的薏米酶解溶液或薏米非酶解溶液1mL，加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.88）2.5mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，充分混合后，在50℃下保溫20min，然后加入10%的三氯乙酸，經(jīng)充分混合后以3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.5mL和0.1%FeCl30.5mL，測(cè)定反應(yīng)液在700nm處的吸光度值。吸光度值越大，即OD值越大，表示還原力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 薏米酶解溫度對(duì)還原性的影響

本實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶對(duì)未經(jīng)發(fā)芽的薏米進(jìn)行水解，其使用溫度范圍是 35～55℃，使用 pH是6.0～7.5。所以用混合磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）配制濃度為40%的薏米粉溶液（即4g薏米粉+6g緩沖溶液），加入中性蛋白酶，并分別在35、40、45、50、55℃的水浴溫度下對(duì)薏米粉進(jìn)行振蕩水解3h。再經(jīng)滅活、離心后，上清液用作還原性測(cè)定［8］。

如圖1可知，在以上水解溫度區(qū)間中，酶解產(chǎn)物的還原力隨著酶解溫度的升高先上升然后下降。40℃時(shí)的OD值最大，說明薏米在40℃的溫度下水解產(chǎn)物具有最大的還原力。隨著溫度的升高，體系內(nèi)能隨之增大，反應(yīng)速度加快，隨著溫度的不斷升高，高于蛋白酶的最適溫度時(shí)，酶逐漸變性。40℃時(shí)，本實(shí)驗(yàn)蛋白酶具有最高的酶解活性，可將蛋白質(zhì)水解得較為充分，形成的多肽具有較強(qiáng)的還原力；而當(dāng)溫度再增加，不僅酶的活性會(huì)降低，又會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)活性造成一定損失。所以實(shí)驗(yàn)的水解溫度定為40℃，以獲得具有較大抗氧化活性的水解產(chǎn)物。

圖1 酶解溫度對(duì)還原性O(shè)D值的影響

2.2 薏米酶解時(shí)間對(duì) DPPH自由基清除能力的影響

將40%的未經(jīng)發(fā)芽的薏米粉緩沖溶液樣品在40℃水浴溫度下進(jìn)行振蕩水解，水解時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6h，水解后立即滅活酶，離心，上清液用作DPPH自由基清除能力測(cè)定。

由圖2可知，薏米蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，到5h時(shí)清除率達(dá)到最大，即抗氧化活性最強(qiáng)，同時(shí)表明水解時(shí)間與抗氧化活性并不呈線性關(guān)系，這與賈薇［3］的結(jié)果相符合。實(shí)驗(yàn)表明不是水解越充分，抗氧化能力越強(qiáng)，而是只有在特定的水解度下，形成特定的結(jié)構(gòu)，水解物才具有較大的抗氧化能力。Je J Y［4］和 Anne Pihlanto［2］的研究結(jié)果也表明，水解物的抗氧化活性與多肽的氨基酸序列有關(guān)。由圖1、圖2可知，薏米水解時(shí)間5h，水解溫度40℃可以獲得具有較高抗氧化活性的水解產(chǎn)物。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

2.3 不同濃度下薏米和酶解薏米抗氧化活性的比較

未經(jīng)發(fā)芽的薏米按照酶解溫度40℃，時(shí)間5h的條件進(jìn)行酶解后，與原薏米配制成不同濃度的溶液，進(jìn)行還原性和清除DPPH自由基的測(cè)定。

由圖3可知，隨著薏米濃度的增加，吸光度值逐漸增大，酶解薏米和非酶解薏米的還原能力不斷增強(qiáng)，呈一定的線性關(guān)系，并且酶解薏米的還原力顯著高于非酶解薏米。

圖3 不同濃度下酶解薏米與原薏米還原力OD值的比較

圖4 酶解薏米和原薏米在不同濃度下自由基清除率的比較

圖4表明，酶解薏米對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用，其對(duì)DPPH自由基的清除能力與濃度呈一定的線性關(guān)系：隨著酶解薏米濃度的增加，其捕獲清除的DPPH自由基也越多。在一定的濃度之下，酶解薏米的DPPH自由基清除率大大高于非酶解的薏米。還原性測(cè)定和消除DPPH自由基能力測(cè)定，這兩種方法共同證實(shí)了酶解薏米的抗氧化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原薏米。相關(guān)分析認(rèn)為，肽的抗氧化活性與其肽段中含有的疏水性氨基酸有關(guān)［4］。薏米蛋白中的多肽鏈緊密折疊，疏水氨基酸殘基在其內(nèi)部形成疏水區(qū)域，蛋白質(zhì)表面被親水外殼所包裹，許多抗氧化氨基酸殘基被包埋于蛋白分子內(nèi)部，不利于與自由基產(chǎn)生作用，影響了其抗氧化效果的發(fā)揮［7］。在酶解過程中，原來包埋于分子內(nèi)部的抗氧化氨基酸殘基顯露出來，釋放出具有抗氧化活性的小分子肽和游離氨基酸，薏米蛋白酶酶解物抗氧化活性高于未酶解的薏米，這為進(jìn)一步研究薏米抗氧化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和機(jī)理，制備具有更強(qiáng)抗氧化性的薏米保健品提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.4 薏米、酶解薏米、發(fā)芽薏米及發(fā)芽后酶解薏米抗氧化活性的比較

發(fā)芽薏米的氨基酸含量明顯高于未發(fā)芽的薏米，氨基酸總量增加95%以上［10］，薏米發(fā)芽1d后，磨成粉進(jìn)行干燥。參照上述薏米及酶解薏米的還原性及清除DPPH自由基能力測(cè)定方法，進(jìn)行發(fā)芽薏米和酶解發(fā)芽薏米的還原性及清除DPPH自由基能力測(cè)定。

還原力測(cè)定的吸光值越大，表示還原力越強(qiáng)。如圖5可知，發(fā)芽后再酶解的薏米有最大的OD值，即最強(qiáng)的還原力，其次是酶解薏米、發(fā)芽薏米和原薏米。

圖5 不同處理方式的薏米在同一濃度下的還原力OD值

由圖6可知，各樣品清除DPPH自由基的能力即抗氧化活性由高到低排列依次為：發(fā)芽后酶解薏米、酶解薏米、發(fā)芽薏米、原薏米，這與還原力測(cè)定的結(jié)果相符。

發(fā)芽后酶解薏米具有最高的抗氧化活性的原因可能是，薏米在發(fā)芽過程中，會(huì)引起維生素C和其他生理活性物質(zhì)的生化變化，增加其抗氧化活性。同時(shí)，內(nèi)源蛋白酶將自身的蛋白質(zhì)水解，肽鍵斷裂，已經(jīng)形成了具有抗氧化活性的多肽。這些多肽和其他未經(jīng)內(nèi)源酶水解的蛋白質(zhì)再經(jīng)過外源酶水解，就增加了更多的抗氧化肽，相比之下，具有較高的抗氧化活性。

圖6 不同處理方式的薏米在同一濃度下的自由基清除率

3 結(jié)論

3.1 薏米經(jīng)不同方法進(jìn)行處理，其產(chǎn)物的抗氧化活性由高到低排序依次為：發(fā)芽后酶解薏米、酶解薏米、發(fā)芽薏米、原薏米。

3.2 薏米經(jīng)蛋白酶酶解均表現(xiàn)出明顯高于原薏米的還原力和清除自由基活性，并隨著濃度的升高而升高。

3.3 中性蛋白酶酶解薏米獲得抗氧化活性的適宜條件是：40℃的水解溫度和5h的水解時(shí)間。水解時(shí)間與抗氧化活性不呈線性關(guān)系。

最近市場(chǎng)上有韓國(guó)的米類飲料面世，價(jià)格相對(duì)來講比較貴，國(guó)內(nèi)也有一些大米飲料方面的研究，但是在市場(chǎng)上還很少見到產(chǎn)品。薏米的蛋白、脂類含量都超過大米，且藥食兼用，目前新加坡、日本等都很推崇薏米食品，薏米產(chǎn)品的開發(fā)具有積極的意義。實(shí)驗(yàn)中采用薏米及發(fā)芽薏米為原料，通過蛋白酶酶解，形成抗氧化性的肽類，同時(shí)其他營(yíng)養(yǎng)成分得以保留，增強(qiáng)了薏米的功能保健效果，制備過程僅采用酶制劑，安全可靠，為開發(fā)具有抗氧化性薏米保健食品具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

［1］劉媛媛.藥食兼用之薏苡仁［J］.食品與健康，2007（1）：28.

［2］Anne Pihlanto.Ant oxidative peptide derived from milk proteins［J］.International Dairy Journal，2006，11（16）：1306 -1314.

［3］賈薇，于國(guó)萍，孟憲金.大米蛋白酶水解物的抗氧化活性研究［J］.食品科技，2008（9）：150-152.

［4］Je J Y，Park PJ，Kim SK.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska Pollack frame protein hydrolysate［J］.Food Research International，2005，38：45-50.

［5］金融.大米蛋白酶解物抗氧化作用研究［D］.南京農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［6］郭亞力，李聰，歐靈澄，等.3種分光光度法對(duì)天然抗氧化物質(zhì)抗自由基性能的分析檢測(cè)［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2004（10）：43-48.

［7］歐仕益，張璟.酶解麥麩產(chǎn)品抗氧化活性研究［J］.食品與機(jī)械，2005（11）：17-19.

［8］王遂，張亞麗，尤旭.玉米種皮中蛋白質(zhì)水解特性的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2000（2）：20-22.

［9］回瑞華，侯冬巖，邢曉燕，等.不同產(chǎn)地稻米抗氧化性能的比較［J］.食品科學(xué)，2007（8）：62-64.

［10］吳傳茂，吳周和，石勇.從必需氨基酸看發(fā)芽薏苡飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［J］.氨基酸和生物資源，1998，20（3）：58-59.

Study on change of antioxidant of adlay power before and after enzymolysis

LI Cun-zhi，OU Shi-yi，ZHOU Qi，YAN Ri-an，ZHANG Ning
（Department of Food Science&Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

The adlay was enzymolysised and it’s antioxidant power was examined by two indicators，which were the anti-DPPH free radical scavenging activity and the reducibility.This study found the suitable hydrolysis condition was：40℃，5h.ln this condition，the product had the highest antioxidant power.And the antioxidant power rise with the increased concentration of adlay.Deeply，other ways to improve the antioxidant power were examined，which were：enzymolysis germinated adlay，enzymolysis adlay，germinated adlay，adlay.This study aims to provide a scientific basis to the development of adlay antioxidant peptide used as safe health product，at the same time，provide a basis for the mechanism for further analysis of antioxidant adlay peptide structure.

adlay；anti-oxidation；enzymolysis

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0100-04

2009-12-14

李存芝（1969-），女，博士，講師，主要從事食品化學(xué)，食品加工方面的研究。

廣東省高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化重大項(xiàng)目資助（cgzhzd0709）；廣州日康大學(xué)生創(chuàng)新基金。