唐 勝，饒國華，陶 紅，趙謀明，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣東中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，廣東廣州510145）

煙末蛋白酶解工藝優(yōu)化的研究

唐 勝1，饒國華2，陶 紅2，趙謀明1，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣東中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，廣東廣州510145）

篩選出了適合煙末蛋白酶解的蛋白酶復(fù)配組合Acalase2.4L與Flavorzyme500MG。通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析法得到最佳酶解條件為：總加酶量10.9‰（以煙末質(zhì)量計(jì)，w/w），酶解時(shí)間8h，酶解溫度49℃。該條件下實(shí)際測得氨基酸態(tài)氮得率為2.270‰，蛋白質(zhì)回收率為31.88%。

煙末，酶解，響應(yīng)面分析

煙末是煙葉切絲過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。我國煙草植物栽培與產(chǎn)量均居世界首位，每年煙葉產(chǎn)量約240萬t，其中約有25%的煙末、煙葉等下腳料不能用于卷煙生產(chǎn)［1］。煙末中含有300多種化合物，包括生物堿、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、甙類、糖類、氨基酸等［2-4］。目前對煙末開發(fā)利用有限，大部分被廢棄。將煙末中蛋白質(zhì)水解成氨基酸，多糖轉(zhuǎn)化成單糖，利用美拉德反應(yīng)制備煙用香精是煙末高值化利用的有效途徑［5］。本文利用蛋白酶直接酶解煙末蛋白，相比于酸法、堿法處理具有反應(yīng)條件溫和且不破壞煙末本身風(fēng)味物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

煙末 由廣東中煙公司提供，為雙喜牌香煙加工過程中產(chǎn)生，蛋白質(zhì)含量7.00%，40℃烘干，粉碎，過 80目篩；Alcalase2.4L、Protamex、PTN6.0S和Flavorzyme500MG 由丹麥諾維信公司提供；Papain由江門拜奧生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

TIM840自動(dòng)電位滴定儀 上海摩達(dá)科學(xué)器材公司；101-3電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海浦東興榮科學(xué)儀器有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煙末蛋白酶解工藝 稱取20.0g煙末，溶于100.0g水，加酶水浴振蕩提取，100℃滅酶15min，在4800r/min、常溫條件下離心20min，取上清液，待測。

1.2.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定 甲醛滴定法［6］。

1.2.3 氨基酸態(tài)氮得率的計(jì)算 氨基酸態(tài)氮得率（‰）=酶解液中總氨基酸態(tài)氮/所用煙末總量×1000‰

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定 克達(dá)爾法［7］。

1.2.5 蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算 蛋白質(zhì)回收率（%）=酶解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料中蛋白質(zhì)的質(zhì)量×100%

1.2.6 數(shù)學(xué)模型的建立 分別用五種蛋白酶酶解煙末蛋白，選出氨基酸態(tài)氮得率最高的蛋白酶與其余四種1∶1復(fù)配，篩選最佳復(fù)配組合，用單因素實(shí)驗(yàn)法研究加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對雙酶復(fù)配酶解煙末蛋白的影響，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，建立數(shù)學(xué)模型，得出最優(yōu)工藝條件。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶雙酶復(fù)配組合的篩選

分別采用Alcalase2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S和Flavorzyme500MG酶解煙末蛋白，酶解條件為：加酶量1%，酶解溫度為50±2℃，自然pH。測定各酶解產(chǎn)物的氨基酸態(tài)氮得率，結(jié)果見圖1。（注：本文中上述蛋白酶在圖中均以簡寫Alc、Pro、Pap、PTN、Fla代替。）

圖1 不同蛋白酶對煙末蛋白酶解效果比較

由圖1可見，五種蛋白酶分別作用于煙末蛋白時(shí)，氨基酸態(tài)氮得率的變化趨勢大致相同，其中6h到10h氨基酸態(tài)氮得率增幅較大，10h到24h氨基酸態(tài)氮得率增加緩慢；各蛋白酶不同時(shí)間段酶解煙末蛋白的效果不同，酶解10h后，Alcalase2.4L對煙末蛋白酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮得率為2.190‰。以上說明不同蛋白酶由于酶作用位點(diǎn)的特異性，對煙末蛋白具有不同的酶解能力。

將氨基酸態(tài)氮得率最高的Alcalase2.4L與其余四種蛋白酶1∶1復(fù)配，對煙末蛋白進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為10h，其余條件與單酶酶解相同。測定各酶解液氨基酸態(tài)氮得率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同蛋白酶復(fù)配對煙末蛋白酶解效果比較

由圖2可見，Alcalase2.4L與 Flavorzyme500MG的復(fù)配效果最佳，在總加酶量相同的條件下，氨基酸態(tài)氮得率比單獨(dú)用 Alcalase2.4L酶解提高了11.75%，這可能是由于Alcalase 2.4L是由選育出來的地衣芽孢桿菌生產(chǎn)而得，其主要有效成分枯草桿菌蛋白酶A是一種內(nèi)切蛋白酶；而Flavorzyme500MG是一種在中性或微酸性條件下酶解蛋白質(zhì)的真菌蛋白酶和肽酶的復(fù)合體，該酶由米曲霉經(jīng)發(fā)酵制得，具有外切蛋白酶活性［8］。許多文獻(xiàn)都報(bào)道，將內(nèi)切蛋白酶與外切蛋白酶結(jié)合使用可以提高酶解的效果［8-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，將內(nèi)切蛋白酶Alcalase 2.4L與具有外切蛋白酶活性的Flavorzyme500MG復(fù)配可提高對煙末蛋白的酶解效果。

總體上來看，用蛋白酶直接酶解煙末蛋白氨基酸態(tài)氮得率不高，這一方面與煙末蛋白本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)；另一方面是由于煙末中纖維素含量較高，一些蛋白被纖維素包裹住，不利于蛋白酶與底物接觸。

2.2 蛋白酶雙酶復(fù)配酶解單因素實(shí)驗(yàn)分析

將Alcalase2.4L與Flavorzyme500MG 1∶1復(fù)配對煙末蛋白進(jìn)行酶解，分別考察加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對酶解的影響。

2.2.1 加酶量對雙酶酶解煙末蛋白效果的影響 由圖3可見，隨著加酶量的增加，氨基酸態(tài)氮得率呈上升趨勢，加酶量達(dá)到7‰以后，增加緩慢，這是因?yàn)槊高M(jìn)行反應(yīng)時(shí)首先要與底物形成一個(gè)中間物，即酶底物復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶濃度時(shí)，反應(yīng)達(dá)到最大速度，如果此時(shí)增加酶的濃度，可增加反應(yīng)速度，酶反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系［11］，在一定的酶解時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)的酶解效率越高，氨基酸態(tài)氮得率也越高。但是加酶量達(dá)到一定比例時(shí)會(huì)使底物的酶切位點(diǎn)飽和，繼續(xù)提高加酶量并不能有效提高酶解效率，反而有可能導(dǎo)致酶自身相互酶解，導(dǎo)致酶活力降低，影響酶解效率的提高。因此，進(jìn)一步增大加酶量，氨基酸態(tài)氮得率并沒有顯著提高。

圖3 加酶量對煙末蛋白酶解效果的影響

2.2.2 酶解時(shí)間對雙酶酶解煙末蛋白效果的影響由圖4可見，隨著酶解時(shí)間的延長，氨基酸態(tài)氮得率呈上升趨勢，其中2h到6h氨基酸態(tài)氮得率增長較快，由1.823‰提高到2.167‰，酶解6h以后，氨基酸態(tài)氮得率增長趨于緩慢，這是因?yàn)?，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度減小，反應(yīng)位點(diǎn)逐漸被酶分子飽和，產(chǎn)物濃度增加，其競爭性抑制變強(qiáng)，同時(shí)酶活性降低，中間復(fù)合物在經(jīng)歷了初始階段的積累后達(dá)到了穩(wěn)態(tài)。

圖4 酶解時(shí)間對煙末蛋白酶解效果的影響

2.2.3 酶解溫度對雙酶酶解煙末蛋白效果的影響由圖5可見，隨著溫度的升高，氨基酸態(tài)氮得率先增加后減小，當(dāng)溫度升到50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮得率達(dá)到最大，這是因?yàn)闇囟葘γ阜磻?yīng)的影響是雙重的：隨著溫度的增加，反應(yīng)速度也增加，直至最大速度為止；隨著溫度升高而酶逐步變性，即通過減少有活性的酶而降低酶的反應(yīng)速度。在一定條件下每一種酶在某一溫度下才表現(xiàn)最大的活力，這個(gè)溫度稱為該酶的最適溫度，最適溫度是上述溫度對酶反應(yīng)雙重影響的結(jié)果［11］。

表3 回歸方程的方差分析表

圖5 酶解溫度對煙末蛋白酶解效果的影響

2.3 響應(yīng)面分析以及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

根據(jù)central composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，選取加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度三個(gè)因素，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，其具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

由響應(yīng)面軟件Design Expert 7.0.0得到的分析結(jié)果見表3。

經(jīng)回歸擬合后，各實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可通過如下的回歸方程表示：

Y=2.02+0.19A+0.075B-1.292E-003C+ 0.012AB-7.750E-003AC-0.010BC-0.018A2-0.018B2-0.090C2

根據(jù)響應(yīng)面分析法，當(dāng)“Prob＞F值”小于0.05時(shí)，說明模型或因素是顯著的，從結(jié)果可知，氨基酸態(tài)氮得率數(shù)學(xué)模型的“Prob＞F值”為0.0055，可見該模型是顯著的，同時(shí)由表3可知，模型中A、B、C2是顯著的因素，各因素的交互作用不是很顯著，又因?yàn)椤盤rob＞F值”越小，因素顯著性越高，因此，可得各個(gè)因素對氨基酸態(tài)氮得率影響的大小順序?yàn)椋杭用噶浚久附鈺r(shí)間＞酶解溫度。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 7.0.0分析，得出煙末蛋白酶解最佳工藝條件是：加酶量10.91‰、酶解時(shí)間8.00h、酶解溫度49.03℃，該條件下，氨基酸態(tài)氮得率理論值為2.251‰。為進(jìn)一步檢驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)方法的可靠性，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件，選取酶解條件為加酶量10.9‰，酶解時(shí)間8h，酶解溫度49℃，進(jìn)行煙末蛋白酶解實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，實(shí)際測得氨基酸態(tài)氮得率為2.270‰，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測值誤差在1%以內(nèi)。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。在最優(yōu)條件下測定蛋白質(zhì)回收率為31.88%。

3 結(jié)論

本文采用五種不同蛋白酶對煙末蛋白進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，選出氨基酸態(tài)氮得率最高的Alcalase 2.4L與其余四種蛋白酶 1∶1復(fù)配，得到最佳的復(fù)配組合Alcalase 2.4L與Flavorzyme500MG，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對酶解的影響，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化煙末蛋白酶解工藝。結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析得到煙末蛋白酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為：加酶量10.9‰、酶解時(shí)間8h、酶解溫度49℃，該條件下，氨基酸態(tài)氮實(shí)際得率為2.270‰，蛋白質(zhì)回收率為31.88%。

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Study on optimization of enzymatic hydrolysis technology of tobacco powder

TANG Sheng1，RAO Guo-hua2，TAO Hong2，ZHAO Mou-ming1，*
（1.College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Technology Center，China Tobacco Guangdong Industrial Corporation，Guangzhou 510145，China）

Acalase2.4L and Flavorzyme500MG were selected which were suitable for tobacco powder enzymatic hydrolysis.Based on the results of single factor test，the yield response was analyzed using method of response surface analysis.The optimized enzymatic hydrolysis conditions were as follows：total enzyme addition 10.9‰（w/w），enzymatic hydrolysis time 8h，enzymatic hydrolysis temperature 49℃.Under these conditions，the amino acid nitrogen yield could be up to 2.270‰，the protein recovery rate could be up to 31.88%.

tobacco powder；enzymatic hydrolysis；response surface analysis

TS49

B

1002-0306（2011）01-0229-04

2009-11-16 *通訊聯(lián)系人

唐勝（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

企業(yè)橫向課題（粵煙工05XM-QK［2008］-001）；企業(yè)橫向課題（粵煙工05XM-QK［2008］第020號(hào)）。