劉 超 孫 輝 楊曉亮 何衛(wèi)江

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京 210093)

一個(gè)具有大Stokes位移的苯并噻唑類pH熒光探針

劉 超 孫 輝 楊曉亮 何衛(wèi)江＊

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京 210093)

本文通過乙烯基將作為熒光團(tuán)的苯并噻唑與作為H+受體的4-吡啶基橋聯(lián)構(gòu)筑了一個(gè)基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制的pH熒光探針BTP2。研究表明該探針的Stokes位移為237 nm，遠(yuǎn)大于相應(yīng)2-吡啶基類似物BTP1。滴定實(shí)驗(yàn)表明該探針的熒光在pH 3.80至5.50之間隨pH值增大而增強(qiáng)，且不受其他金屬離子的干擾，具有檢測胞內(nèi)酸性細(xì)胞器pH的良好前景。探針pKa為4.72，略高于BTP1。4-吡啶基連接導(dǎo)致的更大的Stokes位移表明調(diào)節(jié)吡啶連接位置可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該類探針分子Stokes位移的調(diào)控。

苯并噻唑；pH；Stokes位移；熒光探針

pH值不僅對(duì)物質(zhì)的物化性質(zhì)及其反應(yīng)性能有明顯的影響，而且在生命體系中也有重要功能。一方面細(xì)胞內(nèi)pH值在細(xì)胞增殖和凋亡[1-2]、離子運(yùn)輸[3-4]、內(nèi)吞[1]和肌肉收縮[5-6]等生理過程中都起著重要的作用。另一方面，pH值的變化同樣會(huì)通過間隙連接和信號(hào)通路等影響突觸傳遞、神經(jīng)細(xì)胞興奮性和細(xì)胞間耦合等神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)[7-8]。細(xì)胞內(nèi)pH值與細(xì)胞功能的密切關(guān)系意味著對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH值的精確測量可以為研究小至單個(gè)細(xì)胞器的生理學(xué)和病理學(xué)過程提供關(guān)鍵信息[9]。所以，監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)pH值的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于理解細(xì)胞內(nèi)許多生理功能的機(jī)制有著重要的作用[10]。

自Robert Boyle發(fā)現(xiàn)石蕊試液具有隨pH值變化發(fā)生顏色變化的特性以來，各種酸堿指示劑如酚酞、甲基橙以及相關(guān)pH試紙得到了廣泛的應(yīng)用。這種比色檢測pH值的方法便捷有效，也有較高靈敏度，因此時(shí)至今日仍有許多新型pH比色指示劑的報(bào)道[11-13]。但是比色法也存在著明顯的缺點(diǎn)，無法應(yīng)用到生命體系進(jìn)行活體細(xì)胞造影。另外，比色法的靈敏度較低，而生命體系要求能檢測到微小的pH變化，比如細(xì)胞中0.10～0.20個(gè)單位pH的擾動(dòng)就會(huì)造成心肺和神經(jīng)方面的疾病如阿爾茨海默綜合癥[14-16]以及其他致命的變異[17]。由于熒光探針法具有快速實(shí)時(shí)響應(yīng)、對(duì)細(xì)胞無損傷以及對(duì)pH響應(yīng)靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)，利用熒光探針法對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH變化進(jìn)行檢測已引起人們的廣泛興趣[18-19]。目前報(bào)道的許多pH熒光探針的Stokes位移較小[20-21]，在造影時(shí)容易受到激發(fā)光的干擾。因此，具有較大Stokes位移的pH熒光探針在生物和化學(xué)等方面都具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

Stokes位移是分子探針的重要參數(shù)，較大的Stokes位移有利于克服激發(fā)在熒光造影中的干擾。多種機(jī)制可能使分子具有大的Stokes位移,如pH熒光探針1的Stokes位移為118 nm[22]，主要是由于激子發(fā)射導(dǎo)致了較大的Stokes位移。分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer，ICT)效應(yīng)也可以增大熒光分子的Stokes位移。許多文獻(xiàn)報(bào)道了利用ICT效應(yīng)獲得具有大Stokes位移的離子熒光探針[23-27]，一般Stokes位移都大于100 nm，其中探針2的Stokes位移更是達(dá)到200 nm左右[27]。這一報(bào)道顯示了ICT熒光團(tuán)在構(gòu)建大Stokes位移探針分子方面的優(yōu)勢。我們課題組利用乙烯基橋聯(lián)熒光團(tuán)苯并噻唑和作為質(zhì)子受體吡啶來構(gòu)建了pH熒光探針BTP1[22]。該分子中在苯并噻唑熒光團(tuán)上的N，N-二甲基結(jié)構(gòu)作為電子給體，噻唑/吡啶作為電子受體，使 BTP1 具有 D(donor，給體)-π-A(acceptor，受體)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其ICT效應(yīng)使得分子具有較大的Stokes位移(199 nm)[22]，有利于減少造影過程中激發(fā)光的干擾。這里我們用4-吡啶結(jié)構(gòu)作為H+受體替代了原來的2-吡啶結(jié)構(gòu)構(gòu)建了新的pH探針BTP2，希望4-吡啶結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的分子極性方向變化可以有效改變分子的D-π-A效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)Stokes位移的調(diào)控，更好地克服激發(fā)光的干擾。這一研究有利于發(fā)現(xiàn)通過改變D/A推拉電子能力而調(diào)節(jié)Stokes位移策略之外的新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

常用藥品與試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，使用前未做進(jìn)一步純化。光譜性質(zhì)測試中所用溶劑如甲醇等為光譜純試劑，購自Aldrich公司。水為MILLIPORE系統(tǒng)處理過的超純水。電噴霧質(zhì)譜用LCQ Fleet電噴霧質(zhì)譜儀 (ESI-MS，Thermo Finnigan)測定，并用ISOPRO 3.0程序模擬其同位素分布模式。1H-，13C-NMR在Bruker DRX 500型超導(dǎo)核磁共振儀上用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列測定 (298 K)。紫外光譜用UV3600型紫外-紅外分光光度計(jì)測定。熒光光譜在FS_LS55發(fā)光光譜儀上測定。pH值用PHS-3精密pH計(jì)記錄。

1.2 探針的合成和表征

探針BTP2的合成路線如式1所示。6-N，N-二甲基氨基-2-甲基苯并噻唑根據(jù)文獻(xiàn)方法[22]合成得到。分別稱取一定量的6-N，N-二甲基-氨基-2-甲基苯并噻唑(0.259 g，1.35 mmol)和 4-吡啶甲醛(0.159 g，1.48 mmol)到 50 mL 圓底燒瓶中，加入 6 mL DMF后攪拌溶解。加入 KOH 固體粉末 (0.378 g，6.75 mmol)后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。TLC跟蹤確認(rèn)完全反應(yīng)后向反應(yīng)液中加入H2O(5 mL)，混合溶液用CH2Cl2萃取(10 mL×3)。合并的有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，減壓脫溶獲得紅色固體。硅膠柱層析分離(V乙酸乙酯/V二氯甲烷=1/10)后得橙紅色固體產(chǎn)物 0.12 g，收率32%。

1.3 BTP2的光譜性質(zhì)測試

BTP2用光譜純MeOH配成5 mmol·L-1儲(chǔ)備液放置于4℃冰箱中備用。取BTP2儲(chǔ)備液用光譜純MeOH 和 HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)稀釋成 5 μmol·L-1的溶液(VMeOH/VHEPES=1/9)，然后分別測定熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。以硫酸奎寧作為基準(zhǔn)物[28]，測量BTP2的量子產(chǎn)率。測定所用溶液濃度以使對(duì)應(yīng)熒光激發(fā)波長處吸光度小于0.05為準(zhǔn)。硫酸奎寧以0.05 mol·L-1硫酸溶解稀釋，BTP2則在 MeOH/HEPES體系(VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)中測量。硫酸奎寧的熒光發(fā)射光譜在358 nm波長激發(fā)下測定，BTP2則以378 nm波長的激發(fā)光激發(fā)。分別測量得到兩個(gè)溶液的紫外-可見吸收光譜與熒光光譜后，將數(shù)據(jù)代入如下公式進(jìn)行計(jì)算[29]：

公式中下標(biāo)R與S分別代表基準(zhǔn)物與樣品，Фf表示量子產(chǎn)率，F(xiàn)表示化合物溶液熒光發(fā)射光譜的積分面積，A表示相應(yīng)激發(fā)波長處的吸光度，n為樣品溶液的折射系數(shù)。

BTP2的pH滴定實(shí)驗(yàn)在MeOH/H2O體系(VMeOH/VH2O=1/9)中進(jìn)行。儲(chǔ)備液用光譜純MeOH和MILLIPORE處理過的H2O稀釋，加入不同體積的HCl和NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH，最后混合溶液濃度都為5 μmol·L-1。每次加完充分混合后先用pH計(jì)測量溶液pH，再進(jìn)行熒光光譜測試或紫外-可見吸收光譜測試 (參比溶液為空白的MeOH/H2O溶液，VMeOH/VH2O=1/9)。

金屬離子干擾實(shí)驗(yàn)在MeOH/HEPES體系(VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中探針最終濃度為5 μmol·L-1，堿金屬、堿土金屬濃度為化合物濃度的1000倍，其余金屬離子濃度與化合物濃度相等。充分混勻后進(jìn)行光譜測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 BTP2的吸收和發(fā)射光譜

首先在MeOH/HEPES(VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)溶液中研究了 BTP2(5 μmol·L-1)的光譜性質(zhì)。紫外-可見光譜研究表明BTP2在中性條件下的最大吸收峰為388 nm左右，該吸收峰應(yīng)該是由于苯并噻唑的π-π*躍遷引起的。熒光光譜測試結(jié)果表明BTP2在中性條件下的最大發(fā)射波長和最大激發(fā)波長分別為615 nm和378 nm左右，Stokes位移達(dá)到237 nm，遠(yuǎn)大于BTP1中的199 nm，也大于大部分探針分子的Stokes位移，有利于熒光探針在細(xì)胞造影中的實(shí)際應(yīng)用。顯然4-吡啶結(jié)構(gòu)的引入，有效地調(diào)整了分子極性方向，有利于熒光增大分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，增大了Stokes位移。這說明分子極性方向同分子電荷轉(zhuǎn)移方向的一致能進(jìn)一步穩(wěn)定激發(fā)態(tài)分子，增大Stokes位移，這顯然為該類分子通過調(diào)節(jié)吡啶連接位置調(diào)控Stokes位移克服激發(fā)干擾提供了新思路。另一方面，利用硫酸奎寧作為基準(zhǔn)物質(zhì)，測量得到BTP2的量子產(chǎn)率為0.062。

2.2 BTP2的pH熒光滴定與紫外-可見光滴定

BTP2的熒光pH滴定在含有10%(V/V)甲醇的水溶液中進(jìn)行，使用的激發(fā)波長為378 nm。從圖2b所示結(jié)果可以看出，當(dāng)pH值高于3以上時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。更高的pH值導(dǎo)致熒光迅速增強(qiáng)，但pH＜3.80 時(shí) BTP2 的熒光強(qiáng)度仍然較弱。在 pH＞5.50時(shí)熒光增加已較小，如從pH 5.50升至pH 5.70，熒光增強(qiáng)僅有～6%左右。在pH＞6.0時(shí)，熒光強(qiáng)度已沒有明顯變化。取pH分別為3.07和5.50時(shí)在615 nm處的熒光強(qiáng)度做比較，增強(qiáng)倍數(shù)超過100倍，即使以pH分別為3.77和5.50時(shí)615 nm處的熒光強(qiáng)度做比較，增強(qiáng)倍數(shù)仍超過30倍。在整個(gè)pH滴定過程中，最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長并未發(fā)生移動(dòng)。利用615 nm處的熒光強(qiáng)度對(duì)pH作圖，并用Henderson-Hasselbach方程進(jìn)行曲線擬 合[30]，得到BTP2的pKa值為4.72，與溶酶體等酸性細(xì)胞器的pH值接近，說明BTP2具有檢測溶酶體內(nèi)pH變化的潛在應(yīng)用前景。

BTP2的紫外-可見吸收光譜受pH變化影響相對(duì)比較復(fù)雜(圖 4)。在 pH＞5.5時(shí)，紫外-可見吸收峰略有增強(qiáng)，在pH 6.00以上則基本不變，這種pH效應(yīng)類似于其熒光在該pH范圍內(nèi)的變化趨勢。當(dāng)pH 逐漸從 5.5 減小到 4.06 時(shí)，388 nm 處的 π-π*躍遷峰吸收強(qiáng)度逐漸減弱，而443 nm處的吸收峰逐漸出現(xiàn)并升高。在此過程的等色點(diǎn)表明了1個(gè)質(zhì)子化過程。pH值繼續(xù)降低時(shí)443 nm處的吸收峰逐漸減弱，并在345 nm處出現(xiàn)1個(gè)新的吸收峰，pH降到1.88左右，443 nm處吸收峰完全消失。在這一過程中，在300 nm和380 nm處出現(xiàn)2個(gè)等消光點(diǎn)，表明在這一階段的pH變化過程中，也只有1個(gè)質(zhì)子化反應(yīng)發(fā)生。伴隨著BTP2復(fù)雜的紫外-可見光譜變化的是溶液隨pH變化的溶液顏色。由圖5所示BTP2溶液變化可以看出，在近中性條件下，BTP2溶液為黃色，pH降至5.12左右，溶液顏色一直無明顯變化，pH進(jìn)一步降低，溶液顏色開始變紅，直至pH為4.03左右時(shí)，溶液顏色達(dá)到最深，然后隨著pH的繼續(xù)降低，溶液顏色變淡，直至無色。這一變化過程與紫外-可見吸收光譜體現(xiàn)的2個(gè)接近相反的變化過程是一致的。這顯示BTP2還有一定的pH比色傳感的能力。根據(jù)BTP1的質(zhì)子化過程，對(duì)于BTP2我們可以推測存在2個(gè)質(zhì)子化過程：首先是pH 5.5到pH 4.06間的吡啶氮質(zhì)子化過程，該過程增強(qiáng)了分子拉電子區(qū)域的拉電子效應(yīng)，使得ICT吸收帶明顯紅移。在pH 4.06到pH 1.88這一過程中，N，N-二甲基被質(zhì)子化，導(dǎo)致該基團(tuán)的給電子能力急劇下降，ICT帶接近消失，而芳香環(huán)本身的 π-π* 吸收帶逐漸明顯。 從 pH 5.5～7.4 之間熒光和紫外光譜變化來看，BTP2的量子產(chǎn)率在此區(qū)間變化不大。另一方面，在探針pH響應(yīng)范圍pH 3.8～5.5之間量子產(chǎn)率隨 pH明顯上升，通過測定pH 5.5 和 pH 7.2 紫外和熒光光譜進(jìn)行計(jì)算，pH 5.5時(shí)的量子產(chǎn)率為0.044。

2.3 BTP2與H+結(jié)合方式

為了進(jìn)一步研究BTP2與H+的作用方式，我們對(duì)BTP2在不同的pH(pH=pD-0.4)[31]下進(jìn)行了核磁滴定實(shí)驗(yàn)。BTP2用CD3OD與D2O的混合溶劑溶解，以DCl與NaOD調(diào)節(jié)pH。圖6所示BTP2的核磁滴定圖中，氫質(zhì)子信號(hào)相應(yīng)歸屬已據(jù)式1直接標(biāo)注其上?？梢钥闯鯞TP2的所有質(zhì)子在pH高于5.01時(shí)位移無明顯變化，當(dāng) pH 從 5.01降到 3.91時(shí)，吡啶質(zhì)子Ha和Hb以及近吡啶烯鍵質(zhì)子Hc信號(hào)均向低場發(fā)生了明顯的移動(dòng)，Ha從 8.56移動(dòng)到8.60 ppm，Hb從 7.66(信號(hào)與雙鍵 Hc重合)左右移動(dòng)到7.77 ppm。Hc的核磁信號(hào)也從7.66左右移動(dòng)到了7.72 ppm，其他氫質(zhì)子信號(hào)皆無明顯變化。這一結(jié)果說明在此pH變化過程中僅吡啶環(huán)上的N原子發(fā)生了質(zhì)子化。這也與紫外滴定過程是一致的。pH從3.91繼續(xù)下降到2.49，所有的氫質(zhì)子信號(hào)都開始向低場移動(dòng)，Ha從8.60移動(dòng)到8.72 ppm，Hb從7.77移動(dòng)到8.17 ppm，Hc從7.72移動(dòng)到7.95 ppm，Hd從7.41移動(dòng)到7.54 ppm，He從7.81移動(dòng)到7.87 ppm，Hf從 7.21移動(dòng)到 7.29 ppm，Hg從 7.07移動(dòng)到7.14 ppm，Hh從3.06移動(dòng)到3.10 ppm。在這一個(gè)pH變化過程中雖然吡啶環(huán)以及橋聯(lián)雙鍵上的氫質(zhì)子信號(hào)變化仍然較大，不同的是N，N-二甲氨基上的氫質(zhì)子信號(hào)也發(fā)生了明顯變化。我們推測是N，N-二甲氨基發(fā)生質(zhì)子化，一方面使得直接相連的鄰位甲基質(zhì)子化學(xué)位移向低場移動(dòng)，同時(shí)由于N，N-二甲氨基上由給電子基經(jīng)質(zhì)子化轉(zhuǎn)為拉電子基，使得整個(gè)共軛體系的電子云密度下降，因此吡啶和乙烯基上的質(zhì)子信號(hào)同樣向低場移動(dòng)。結(jié)合熒光光譜對(duì)pH的變化可知，在pH從5.50降至3.77時(shí)過程中主要是吡啶N原子的質(zhì)子化導(dǎo)致了熒光隨pH降低而逐漸淬滅，這與文獻(xiàn)報(bào)道過的情況相一致[32]。pH繼續(xù)下降則導(dǎo)致N，N-二甲氨基徹底質(zhì)子化，整個(gè)分子不再具有D-π-A結(jié)構(gòu)，不再具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，因此熒光幾近于消失。

2.4 BTP2對(duì)H+的選擇性響應(yīng)研究

一個(gè)具有良好響應(yīng)性能的pH探針在實(shí)際應(yīng)用到細(xì)胞或環(huán)境中，應(yīng)該不受體系其他因素的干擾，比如不受金屬離子的干擾。對(duì)此，我們在MeOH/HEPES 體系 (VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20) 的混合溶液中 ，對(duì)BTP2與各種金屬離子響應(yīng)性能進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 (圖7)，溶液中與BTP2等濃度的Ag+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Pb2+和 Zn2+等過渡金屬離子的存在不會(huì)對(duì)BTP2的熒光產(chǎn)生明顯的影響，因此不會(huì)對(duì)其pH熒光響應(yīng)性能產(chǎn)生干擾。另外細(xì)胞中具有較高濃度的 K+、Na+、Ca2+和 Mg2+等堿金屬和堿土金屬離子即使在過量1000倍的濃度情況下，也不會(huì)對(duì)BTP2的熒光產(chǎn)生明顯的改變。因此細(xì)胞中的這些高濃度離子同樣不會(huì)對(duì)BTP2的pH響應(yīng)能力產(chǎn)生干擾。顯然BTP2和BTP1一樣具有良好的pH響應(yīng)專一性，符合應(yīng)用到細(xì)胞內(nèi)檢測pH變化的要求。

3 結(jié) 論

利用乙烯基將苯并噻唑熒光團(tuán)與4-吡啶環(huán)橋聯(lián)，得到了一個(gè)具有D-π-A結(jié)構(gòu)的熒光探針BTP2。該探針的pKa為4.72，熒光在pH 3.8到5.5的變化范圍內(nèi)隨pH增大而增強(qiáng)，并且常見金屬離子的存在不會(huì)對(duì)其pH響應(yīng)性能造成干擾，適用于胞內(nèi)酸性環(huán)境如溶酶體等的pH檢測。該探針具有比相應(yīng)2-吡啶類似物BTP1更大的Stokes位移，可以更好地克服激發(fā)光的干擾，同時(shí)也表明該類探針分子可以通過調(diào)節(jié)橋聯(lián)吡啶連接位置來調(diào)節(jié)其Stokes位移。探針的量子產(chǎn)率雖然不高，但利用當(dāng)前日臻成熟的造影設(shè)備已經(jīng)可以輕松實(shí)現(xiàn)細(xì)胞造影。本研究同時(shí)表明利用ICT熒光團(tuán)構(gòu)建各類熒光探針時(shí)必須考慮推拉電子基團(tuán)的位置，以獲得較大的分子極性，促進(jìn)光致電荷轉(zhuǎn)移，獲得較大的Stokes位移，降低激發(fā)在造影中的干擾。

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A New Benzothiazole-Derived pH Fluorescent Sensor of Large Stokes Shift

LIU Chao SUN HuiYANG Xiao-Liang HE Wei-Jiang＊
(State Key Laboratory of Coordination Chemistry,School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing 210093,China)

A new intramolecular charge transfer pH fluorescent sensor BTP2 was constructed by vinyl bridging benzothiazole fluorophore with the H+acceptor,4-pyridyl group via a vinyl group.Emission spectroscopic study disclosed that this new compound has a Stokes shift of 237 nm,which is much larger than that of its analogue BTP1 of 2-pyridyl group.Titration experiment indicated that the emission of BTP2 increases with pH in the pH range from 3.80 to 5.50.Moreover,this pH sensing ability is not interfered by the coexisting metal cations,which provides BTP2 the potential for intracellular pH imaging of acidic organelles.Its pKais around 4.72,slightly larger than that of BTP1.The 4-pyridyl group induced larger Stokes shift implies that altering the bridging site of pyridyl group might be an effective means to regulate the Stokes shift of these pH probe.

benzothiazole;pH;Stokes shift;fluorescent sensor

O

A

1001-4861(2011)11-2121-07

2011-00-00。收修改稿日期：2011-00-00。

國家自然科學(xué)基金(No.20871066、10979019、21021062)、國家重大基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011CB935800)、江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK2009227)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：heweij69@nju.edu.cn