宋宏新，孫 斌，薛海燕，徐大鵬

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021; 2.徐州市睢寧縣職業(yè)教育中心，江蘇徐州221200)

食品中大腸桿菌O157:H7的兩種檢測(cè)方法研究

宋宏新1，孫 斌1，薛海燕1，徐大鵬2

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021; 2.徐州市睢寧縣職業(yè)教育中心，江蘇徐州221200)

研究食品中大腸桿菌O157∶H7的兩種檢測(cè)方法，PCR法引物針對(duì)特異性粘附毒素基因(eaeA)擴(kuò)增檢測(cè)，雙抗夾心ELISA采用雞抗O157∶H7特異性脂多糖(LPS)抗體(IgY)檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法對(duì)純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度都在103～104cfu/mL之間，特異性能滿足食品檢測(cè)需求;PCR法的敏感度較ELISA法高，且較省時(shí)。經(jīng)以牛奶為參考的食品模擬樣品(37℃增菌14h)驗(yàn)證兩種檢測(cè)方法的最低檢出限均為2.5cfu/25mL樣品。

大腸桿菌O157∶H7，食源性病原菌檢測(cè)，雙抗夾心ELISA，PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coli O157∶H7 EDL 933株 由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng);普通大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、枯草桿菌 均為陜西科技大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室保藏;Anti-E.coli O157∶H7 LPS-IgY及其酶標(biāo)抗體(HRP-IgY) 前期實(shí)驗(yàn)制備［4-5］;TMB、新生霉素增菌肉湯 均購(gòu)于西安羅森伯科技有限公司;柱式基因組DNA抽提試劑盒、Easy PCR擴(kuò)增試劑盒以及BIOWEST ARGROSE 均購(gòu)于北京天根生物科技有限公司;引物合成 北京奧科生;市售牛奶 購(gòu)于西安市農(nóng)場(chǎng)。

MK3型酶標(biāo)儀 荷蘭Wellscan-MK-3;酶標(biāo)板西安舟鼎國(guó);移液槍 德國(guó)Eppendorf;PCR儀 美國(guó)MJ RESEARCH;水平電泳槽 北京六一;凝膠成像分析系統(tǒng) 南京捷達(dá)科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR檢測(cè)方法 PCR引物針對(duì)E.coli O157∶H7的特異性粘附毒素基因(eaeA)［6］應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物，結(jié)果見表1。

表1 PCR引物及相關(guān)產(chǎn)物

表2 棋盤滴定法測(cè)定包被抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)果

PCR模板用柱式基因組DNA抽提試劑盒提取大腸桿菌O157∶H7基因組DNA，DNA含量測(cè)定用紫外分光光度法，模板的純度用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR過程參考Easy PCR試劑盒說明書。

1.2.2 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法［7］

1.2.2.1 雙抗體夾心 ELISA 法檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7 捕獲抗體采用雞抗O157∶H7特異性脂多糖(LPS)抗體(IgY)，其酶標(biāo)抗體(HRP-IgY)作為檢測(cè)抗體。

1.2.2.2 棋盤滴定法同時(shí)測(cè)定包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度 包被抗體的濃度分別用包被緩沖液稀釋為25、12.5、6.25μg/mL，在每種包被濃度又分別進(jìn)行強(qiáng)陽性抗原(E.coli O157∶H7 108cfu/mL)、弱陽性抗原(E.coli O157∶H7 104cfu/mL)和陰性對(duì)照液三種實(shí)驗(yàn);將酶標(biāo)IgY按1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280進(jìn)行稀釋。

1.2.3 檢測(cè)方法的敏感性實(shí)驗(yàn) 將大腸桿菌O157∶H7純培養(yǎng)物的濃度調(diào)整為1.0×109cfu/mL，分為兩份，一份用于測(cè)定雙抗體夾心ELISA法敏感性，一份用于PCR敏感性的檢測(cè)，同時(shí)以普通大腸桿菌作對(duì)照。

1.2.4 牛奶模擬參考樣品的檢測(cè) 于25mL巴氏滅菌牛奶中分別接種濃度為104、103、102、10、5、2.5、1.25cfu/mL的大腸桿菌O157∶H7液制成模擬樣品，以生理鹽水做陰性對(duì)照，然后將其加入225mL新生霉素增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)14h。再將每一稀釋度各取兩份反復(fù)離心洗滌，一份煮沸10min進(jìn)行雙抗夾心ELISA實(shí)驗(yàn)，一份用于提取基因組DNA進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，比較這兩種方法在模擬樣品中的檢測(cè)靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙抗夾心ELISA的建立

用棋盤滴定法同時(shí)測(cè)定包被抗體和酶標(biāo)抗體的濃度，測(cè)定結(jié)果見表2。

包被抗體和酶標(biāo)抗體的濃度是雙抗夾心ELISA中必須控制的兩個(gè)關(guān)鍵要素。由表2可知，包被抗體的最適工作濃度為12.5μg/mL，酶標(biāo)抗體的最適工作濃度為1∶160，兩個(gè)指標(biāo)在同一反應(yīng)中確定可消除同種動(dòng)物抗體對(duì)抗原表位的競(jìng)爭(zhēng)所產(chǎn)生的交互影響作用。

2.2 PCR方法的建立

2.2.1 PCR模板制備結(jié)果 基因組DNA用試劑盒提取后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260值為0.051，可計(jì)算提取基因組DNA的濃度為0.64μg/μL;瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度(見圖1中的泳道9)，由檢測(cè)結(jié)果可見，經(jīng)試劑盒提取的DNA得率和純度都較高，完全滿足PCR需求。

圖1 引物及模板濃度對(duì)PCR影響注:1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);9.模板DNA; 2～4模板量依次為:0.16、0.32、0.64(μg); 5～8引物濃度依次為:10、15、20、25(μmol/L)。

2.2.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 由于采用試劑盒PCR擴(kuò)增體系，僅對(duì)引物濃度和模板濃度進(jìn)行確定，其結(jié)果見圖1。

由圖1可知，模板加量為0.16μg時(shí)，PCR條帶已較清楚，故選模板的最適量為0.16μg;在此模板加量，引物濃度在15μmol/L有清晰的條帶出現(xiàn)，故選取該條件為最適PCR反應(yīng)體系。

2.3 檢測(cè)方法的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大腸桿菌O157∶H7純培養(yǎng)物的雙抗夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果見表3，PCR檢測(cè)結(jié)果見圖2。

表3顯示雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的敏感度小于104cfu/mL;圖2表明PCR檢測(cè)的敏感度為103cfu/mL，可見兩種檢測(cè)方法的敏感度相當(dāng)，PCR法較雙抗夾心ELISA要靈敏。目標(biāo)基因及其引物通過Blast搜索，所得分值較高的一些菌有可能造成假陽性結(jié)果，但食源性微生物中僅以普通大腸桿菌較為常見，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示普通大腸桿菌經(jīng)PCR實(shí)驗(yàn)沒有條帶出現(xiàn)。作者已研究過食品中常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌的免疫反應(yīng)特性，IgY與普通大腸桿菌有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，與其它幾種菌的交叉反應(yīng)較弱［8］，對(duì)兩種檢測(cè)方法特異性的研究還有待深入。

表3 雙抗夾心ELISA敏感性檢測(cè)

表4 牛奶模擬樣品中大腸桿菌O157∶H7的ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖2 PCR檢測(cè)方法敏感性檢測(cè)

2.4 食品模擬樣品的檢測(cè)

將巴氏滅菌牛奶中接入不同濃度的大腸桿菌O157∶H7，制備成模擬樣品，以牛奶樣品為對(duì)照，經(jīng)14h選擇性增菌培養(yǎng)來考察檢測(cè)的敏感性及實(shí)用性，雙抗體夾心ELISA法的結(jié)果見表4，PCR方法的結(jié)果見圖3。

圖3 牛奶樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果

由表4和圖3可見，雙抗夾心ELISA法和PCR法檢測(cè)牛奶樣品的最低檢出限均為2.5cfu/25mL樣品，表明兩種檢測(cè)方法的靈敏度相當(dāng)，這一結(jié)果與趙志晶等［9］所用雙抗夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果(0.1cfu/mL樣品)相同，比Nathalie Y.Fortin等［10］人用PCR法檢測(cè)的結(jié)果(1cfu/mL樣品)要高，可用于食品樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論

綜上所述，實(shí)驗(yàn)研究的食品中大腸桿菌O157∶H7的雙抗夾心ELISA和PCR檢測(cè)方法的靈敏度都較高，對(duì)大腸桿菌O157∶H7的純培養(yǎng)物的檢測(cè)都在103～104cfu/mL之間，模擬樣品增菌后的檢測(cè)兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)限都為2.5cfu/25mL樣品;雙抗夾心ELISA和普通大腸桿菌有交叉，兩種方法對(duì)食品中其它常見菌株有良好的選擇性。ELISA方法要比PCR成本低，且易于普及推廣;不包括樣品增菌時(shí)間，ELISA檢測(cè)需要約6h，PCR檢測(cè)僅為3.5h左右，PCR方法省時(shí)。對(duì)兩種方法的特異性及應(yīng)用方法學(xué)(試劑盒化、重復(fù)性)等方面的問題還有待深入研究。

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Comparison of two methods on detecting Escherichia Coli O157∶H7 strain in foods

SONG Hong-xin1，SUN-Bin1，XUE Hai-yan1，XU Da-peng2
(1.College of Life Science＆Engineering，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an 710021，China; 2.Vocational Education Center of Suining，Xuzhou 221200，China)

To detect Escherchia Coli O157∶H7 in foods，two methods such as the double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay and PCR were developed.A specific primer had been successfully designed to amplify eaeA gene in PCR detection.In the double sandwich antibody ELISA，the specific anti-E.coli O157∶H7 LPS-IgY was used.As a result，the limits of tow detections were 103～104cfu/mL in pure culture of E.coli O157∶H7 and the PCR was a little higher and faster than ELISA.In analogue milk detection，the detection limits of two methods were all 2.5cfu/25mL after 14h enrichment.

Escherchia Coli O157∶H7;food borne pathogen detection;double-antibody sandwich ELISA;PCR

TS207.4

A

1002-0306(2011)03-0402-03

大腸桿菌O157∶H7是近年來出現(xiàn)的嚴(yán)重危害人類身體健康的一種食源性病原微生物，它是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC)的一個(gè)主要血清型。自1983年美國(guó)Riley等［1］人首次報(bào)道以來，相繼在世界許多國(guó)家都出現(xiàn)爆發(fā)性和散發(fā)性流行性病例。牛等反芻動(dòng)物是該菌的主要攜帶者［2］，而人類被感染的主要來源是直接或間接食用被污染的這些動(dòng)物食品。人感染EHEC O157∶H7輕度者將會(huì)出現(xiàn)短暫腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者導(dǎo)致劇烈腹痛、出血性結(jié)腸炎、溶血性貧血癥、血小板減少性紫癜和溶血性尿毒綜合癥［3］。本文就酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)及PCR技術(shù)對(duì)食品中的大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行檢測(cè)研究。

2010-02-26

宋宏新(1959-)，男，教授，碩士，研究方向:食品免疫檢測(cè)技術(shù)。

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009K02-09);陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目(09JC19)。