宋 慶，張赟彬

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234; 2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海200235)

豆豉中乙酰膽堿酯酶抑制劑的提取與富集工藝研究

宋 慶1，張赟彬2，*

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234; 2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海200235)

研究單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化豆豉中乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑的提取工藝。粗提液依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并對(duì)石油醚萃取相選用七種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂富集，通過Ellman法對(duì)豆豉提取物體外AchE抑制能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，最佳提取工藝為:提取時(shí)間60min，乙醇濃度80%，溫度70℃，固液比1∶10時(shí)，1.0mg/mL的豆豉提取液對(duì)AchE的抑制率為52.33%;各有機(jī)溶劑的萃取組分在1.0mg/mL時(shí)的AchE抑制率分別為:石油醚組分75.52%、二氯甲烷組分61.00%，乙酸乙酯組分70.84%和正丁醇組分26.73%;HZ-801型大孔樹脂具有較好的吸附性能，最佳富集工藝為:靜態(tài)吸附3.0h，吸附飽和的樹脂以80%乙醇動(dòng)態(tài)洗脫，洗脫流速1.0mL/min，富集后的洗脫液對(duì)AchE抑制率達(dá)83.67%。

豆豉，萃取，乙酰膽堿酯酶抑制劑，大孔吸附樹脂

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 購(gòu)于徐匯區(qū)漕河涇菜場(chǎng)，產(chǎn)地為重慶永川;無(wú)水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 國(guó)藥集團(tuán)，分析純;乙酰膽堿酯酶(AchE)、硫代乙酰膽堿(ATch)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)sigma公司。

DJ靈巧型粉碎機(jī) 上海淀久中藥器械制造有限公司;754紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;冷凍真空干燥機(jī)上海照生有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙酰膽堿酯酶抑制劑的測(cè)定方法的建立

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理 根據(jù)Ellman的方法［5］，底物硫代乙酰膽堿(ATch)在乙酰膽堿酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代膽堿(Thiocholine)，硫代膽堿與顯色劑DTNB迅速作用，生成在412nm處有光吸收的黃色物質(zhì)，在酶催反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)階段，其OD值即可代表起始反應(yīng)速率。

1.2.1.2 豆豉提取液中AchE抑制率的測(cè)定［6］在試管中加入2900μL的PBS，20μL 1.0U/mL的乙酰膽堿酯酶和100μL稀釋到一定濃度的豆豉提取物，37℃預(yù)熱 10min，然后依次加入 15mmol/L的 DTNB 50μL，15mmol/L的 ATch 50μL，37℃ 水浴反應(yīng)20min，加入1.0mL的4%SDS終止反應(yīng)，迅速測(cè)其412nm的OD值，記為A樣品，每個(gè)樣品作3個(gè)平行，取平均值。由于豆豉提取物多有顏色，所以每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做一個(gè)本底扣除，即用20μL PBS代替乙酰膽堿酯酶，記為A本底;因豆豉提取物用10%乙醇溶液溶解，可能乙醇溶液本身就會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿酯酶失活，所以以10%乙醇代替提取物作為對(duì)照，記為A對(duì)照;再做空白對(duì)照組，即用100μL PBS代替豆豉提取物，記為A空白。

抑制率的計(jì)算公式:

1.2.2 豆豉提取液的制備

1.2.2.1 樣品的預(yù)處理 豆豉真空干燥后，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 豆豉不同溶劑提取液的制備 在3個(gè)錐形瓶中分別裝入10.0g凍干豆豉粉末，分別加入水、甲醇和無(wú)水乙醇100mL，在30℃下振蕩(120r/min)提取2h。將提取液于4000r/min離心20min，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，冷凍真空干燥后4℃保存?zhèn)溆?，樣品?00mmol/L pH 8.0的PBS稀釋至一定濃度梯度。

1.2.2.3 豆豉不同時(shí)間提取液的制備 在8個(gè)錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，然后分別加入無(wú)水乙醇100mL，在30℃下分別振蕩(120r/min)提取15、30、45、60、120和240min。后處理同1.2.2.2。

1.2.2.4 豆豉不同固液比提取液的制備 在4個(gè)錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，分別加入無(wú)水乙醇50、100、150和200mL，在30℃下振蕩(120r/min)提取60min，后處理同1.2.2.2。

1.2.2.5 豆豉不同乙醇濃度提取液的制備 在4個(gè)錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，然后分別加入40%、60%、80%和100%(體積比)的乙醇水溶液100mL，后處理同1.2.2.2。

1.2.2.6 豆豉不同溫度提取液的制備 在5個(gè)錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，然后分別加入80%的乙醇水溶液100mL，分別在30、50、70和90℃的溫度下提取60min，后處理同1.2.2.2。

1.2.2.7 豆豉粗提液的萃取處理 稱取豆豉粉末100.0g，按照優(yōu)化的提取工藝制備粗提液，將粗提液減壓濃縮，得到的浸膏依次用石油醚(100×3)、二氯甲烷(100×3)、乙酸乙酯(100×3)和正丁醇(100× 3)萃取，合并各萃取液。將各萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏后冷凍真空干燥至粉末，然后用10%乙醇將各組分稀釋成1.0mg/mL溶液。按照1.2.1.2測(cè)定各萃取組分對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.3 大孔樹脂富集豆豉提取液中乙酰膽堿酯酶抑制劑

1.2.3.1 大孔樹脂的選擇 分別取預(yù)處理過的D3520、NKA-Ⅱ、H103、NKA-9、ADS-7、HZ-801和HZ-818型大孔樹脂各1.0g于錐形瓶中，加入上樣液50mL，置于搖床中振蕩過夜(20℃，120r/min)，過濾，測(cè)定濾液中乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度;選擇吸附效果較好的大孔樹脂，待其吸附飽和后過濾，樹脂用去離子水清洗，然后放回錐形瓶中，加入80%的乙醇50mL，置于搖床中振蕩過夜(20℃，120r/min)，過濾，測(cè)定洗脫液中乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度。按下式計(jì)算大孔樹脂對(duì)乙酰膽堿酯酶的吸附率與解吸率:

式中:I前，I后分別為吸附前后上樣液對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率;I解為解吸液對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.3.2 HZ-801大孔樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 稱取處理好的HZ-801大孔樹脂3份，每份1.0g，于150mL的錐形瓶中，加入上樣液50mL，置于搖床中振蕩，每30min從溶液中取樣，測(cè)定溶液對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.3.3 乙醇濃度對(duì)解吸的影響 取吸附飽和的HZ-801大孔樹脂5份，每份1.0g，于150mL的錐形瓶中，用濃度為60%、70%、80%、90%和100%的乙醇進(jìn)行解吸，解吸完全后，測(cè)定相關(guān)溶液對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率，計(jì)算出解吸率。

1.2.3.4 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)解吸 將吸附飽和的HZ-801大孔樹脂100.0g裝入層析柱中，然后以80%乙醇溶液以0.5、1.0、1.5、2.0mL/min的流速洗脫，確定最佳流速。解吸液每50mL為一流分，并測(cè)定每個(gè)流分對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 不同溶劑的豆豉提取液對(duì)AchE的抑制率

結(jié)果表明，用乙醇作為豆豉的提取溶劑，提取液濃度在1.0mg/mL時(shí)對(duì)AchE的抑制率較高，而水提液對(duì)AchE的抑制率很低，可以粗略地判斷提取液中有效成分為弱極性或者非極性物質(zhì)，因此選擇乙醇作為提取溶劑。

表1 不同溶劑的豆豉提取液對(duì)AchE的抑制率(1.0mg/mL)

2.1.2 不同時(shí)間的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響 實(shí)驗(yàn)表明，在60min前，提取物中乙酰膽堿酯酶抑制物的含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增加，60min后，提取物對(duì)AchE抑制率逐漸下降，可能是隨著提取時(shí)間增加，提取液中非AchE抑制成分的含量增多，導(dǎo)致提取物濃度在1.0mg/mL時(shí)的有效成分相對(duì)含量降低，綜合考慮，確定最佳提取時(shí)間為60min。

圖1 不同時(shí)間的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

2.1.3 不同固液比的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響 實(shí)驗(yàn)表明，在固液比大于1∶10時(shí)，豆豉提取液對(duì)AchE抑制率基本保持不變，考慮到提取操作的經(jīng)濟(jì)性，確定固液比為1∶10時(shí)可以有效地提取豆豉中有效活性物質(zhì)。

圖2 不同固液比的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

2.1.4 不同乙醇濃度的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響 實(shí)驗(yàn)表明，隨著乙醇濃度的變化，提取液對(duì)AchE抑制率變化有一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì);在乙醇濃度為80%時(shí)，豆豉提取液對(duì)AchE抑制率最高。乙醇水溶液作為提取溶劑，其中，水的存在能幫助滲透豆豉組織，提高滲透性，更易于有效成分溶于溶劑體系中，從而游離到胞外。80%的乙醇對(duì)豆豉中AchE抑制成分的提取效果較好。

圖3 不同乙醇濃度的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

2.1.5 不同溫度下的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響 實(shí)驗(yàn)表明，隨著溫度升高，豆豉提取液對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度逐漸增加，說(shuō)明豆豉中的AchE抑制成分熱穩(wěn)定性較好，因此確定提取最適溫度為70℃。

圖4 不同溫度下的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、固液比、乙醇濃度、提取溫度等單因素實(shí)驗(yàn)，確定提取工藝為:浸提時(shí)間為60min，固液比為1∶10，乙醇濃度為80%，溫度為70℃;該提取工藝更易于豆豉中AchE抑制成分的提取，在該工藝條件下，濃度為1.0mg/mL的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率為52.33%。

2.1.6 各有機(jī)溶劑萃取組分對(duì)AchE的抑制率 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前三種萃取組分對(duì)AchE的抑制率都較強(qiáng)，其中以石油醚萃取相活性最高，其具體的化學(xué)成分還有待進(jìn)一步分析。已有的文獻(xiàn)報(bào)道表明［7］，脂肪酸，甘油酯，長(zhǎng)鏈烴類化合物，極性小、含氧取代低的萜類、甾體，生物堿等是石油醚萃取相中的主要組成成分，并且已有多種生物堿類和萜類被報(bào)道具有AchE抑制活力，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)對(duì)石油醚萃取相進(jìn)行富集和進(jìn)一步分離純化。

表2 各有機(jī)溶劑萃取組分對(duì)AchE的抑制率(1.0mg/mL)

2.2 大孔樹脂對(duì)石油醚相中乙酰膽堿酯酶抑制劑的富集

2.2.1 靜態(tài)吸附法篩選大孔樹脂 選擇極性不同的7種大孔樹脂對(duì)石油醚相中乙酰膽堿酯酶抑制劑富集，綜合吸附率與解吸率篩選性能較好的樹脂，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HZ-801對(duì)石油醚相中的AchE抑制劑的靜態(tài)吸附及解吸性能都較好，優(yōu)于其他幾種樹脂，是富集乙酰膽堿酯酶抑制劑較理想的吸附劑。

表3 不同吸附樹脂對(duì)AchE抑制劑的吸附率和解吸率

2.2.2 HZ-801大孔樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 樹脂對(duì)石油醚相中乙酰膽堿酯酶抑制劑的吸附特性不僅表現(xiàn)在吸附量和選擇性上，其吸附速度也是重要的影響因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酰膽堿酯酶抑制劑在HZ-801大孔樹脂上經(jīng)過3.0h后基本達(dá)到吸附平衡，平衡時(shí)的吸附率為85.44%，因此在以后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)使吸附時(shí)間大于3.0h，以確保吸附平衡。

圖5 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.3 乙醇濃度對(duì)解吸性能的影響 實(shí)驗(yàn)表明，隨著乙醇濃度的升高，解吸率也隨之升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%以上后，解吸率上升緩慢，考慮到乙醇的用量，做到降低富集的成本，確定用80%的乙醇作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的解吸液，解析率為88.12%，解吸液對(duì)AchE抑制率為81.89%。

圖6 乙醇濃度對(duì)解吸的影響

2.2.4 流速對(duì)解吸性能的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以80%的乙醇溶液為洗脫液，解吸率隨流速的增高而降低，以0.5mL/min和1.0mL/min洗脫時(shí)，洗脫效果較好，考慮到實(shí)驗(yàn)效率，因此選用1.0mL/min的流速進(jìn)行洗脫為宜，解析率達(dá)到91.03%，解吸液對(duì)AchE抑制率達(dá)83.67%。相對(duì)靜態(tài)解吸有明顯提高，見圖7。

2.2.5 動(dòng)態(tài)解吸曲線 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇溶液以1.0mL/min洗脫時(shí)，乙酰膽堿酯酶抑制劑迅速被洗脫下來(lái)，洗脫液通過500mL后，吸附在樹脂上的乙酰膽堿酯酶抑制劑基本洗脫下來(lái)，解吸曲線出峰快，且無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。詳見圖8。

3 結(jié)論

3.1 用不同溶劑(水、甲醇、乙醇)提取豆豉，乙醇提取物對(duì)AchE的抑制率最高。

圖7 不同流速對(duì)解吸的影響

圖8 動(dòng)態(tài)解吸曲線

3.2 提取時(shí)間、固液比、乙醇濃度、提取溫度對(duì)豆豉中AchE抑制成分的提取都存在影響，最佳提取工藝為:浸提時(shí)間為60min，固液比為1∶10，乙醇濃度為80%，溫度為70℃;濃度為1.0mg/mL的豆豉提取液對(duì)AchE抑制率最高為52.33%。

3.3 粗提液經(jīng)下述有機(jī)溶劑進(jìn)一步萃取，石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯組分對(duì)AchE抑制率較強(qiáng)，分別為: 75.52%、61.00%、70.84%;正丁醇組分對(duì)AchE抑制率較弱為:26.73%。

3.4 通過篩選大孔樹脂對(duì)石油醚相中的乙酰膽堿酯酶抑制劑進(jìn)行富集，綜合吸附性能與解吸性能，選擇HZ-801大孔樹脂富集乙酰膽堿酯酶抑制劑。HZ-801大孔樹脂3.0h后吸附飽和，其動(dòng)態(tài)解吸性能比靜態(tài)解吸性能好。吸附飽和的樹脂以80%乙醇、1.0mL/min洗脫時(shí)，解吸率達(dá)到91.03%，洗脫液對(duì)AchE抑制率達(dá)83.67%。解吸曲線出峰快，且無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。

［1］李前，朱振霞，孫曼霽.乙酰膽堿酯酶與老年性癡呆關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2002，22(4):325-326.

［2］陳科茂.乙酰膽堿酯酶抑制劑藥物“激活”老年癡呆癥市場(chǎng)［J］.中國(guó)醫(yī)藥情報(bào)，2004，10(6):48.

［3］Ibach B，Haen E.Acetylcholinesterase Inhibition in Alzheimer’s Disease［J］.Current Pharmaceutical Design，2004，10:231-251.

［4］管立軍，程永強(qiáng)，李里特.腐乳和豆豉功能性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)物與營(yíng)養(yǎng)，2008(11):48-51.

［5］Ellman G L，Courtney K D，Andres V Jr，et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity［J］.Biochem Pharmacol，1961，7:88-95.

［6］張翼，馮妍，李曉明，等.海藻組分抑制乙酰膽堿酯酶活性研究［J］.海洋與湖沼，2005，36(5):459-463.

［7］Faulkner D J.Marine natural products［J］.Natural Product Reports，2001，18(1):1-49.

Extraction and enrichment technique of acetylcholinesterase inhibitor from Douchi

SONG Qing1，ZHANG Yun-bin2，*
(1.College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China; 2.School of Perfume and Aroma Technology，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 200235，China)

Extraction of acetylcholinesterase(AchE)inhibitor from Douchi was optimized through single factor experiment.Crude extract was extracted by petroleum ether，methylene chloride，ethyl acetate and n-butanol extract in turn，and the petroleum ether fraction was enriched with macroporous resin.Ellman’s method was used to determine AchE inhibitory activity in vitro.The results showed that the optimum extraction condition were with the extract time of 60min，ethanol concentration of 80%，extraction temperature of 70℃，ratio of liquid/solid of 1∶10. 1.0mg/mL of Douchi extract showed 52.33%AchE inhibition rate.Crude Douchi extract was further extracted.The AchE inhibition rate of 1.0mg/mL extract by following solvent was as follows:75.52%by petroleum ether，61.00%by methylene chloride，70.84%by ethyl acetate and 26.73%by n-butanol.HZ-801 macroporous resin was selected to enrich acetylcholinesterase inhibitor.The optimum enrichment conditions were absorbed time of 3.0h，elution solvent of 80%ethanol，and 1.0mL/min elution rate.After enrichment，the AchE inhibition rate could reach 83.67%.

Douchi;extract;acetylcholinesterase inhibitor;macroporous resin

TS214.9

B

1002-0306(2011)03-0285-04

乙酰膽堿酯酶(acetylchlinesterase，AchE)是老年癡呆疾病阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)的一個(gè)酶抑制劑作用靶點(diǎn)，AchE催化乙酰膽堿的裂解反應(yīng)，導(dǎo)致乙酰膽堿的缺失，直接造成神經(jīng)信號(hào)傳遞失敗，引起老年癡呆癥［1］。如今，隨著人口老齡化速度的快速增加，AD病人日益增多，已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后嚴(yán)重威脅老年人生命健康的主要疾病之一。據(jù)預(yù)測(cè)，我國(guó)在21世紀(jì)中葉，60歲以上的老齡人口將達(dá)到4億左右，并將成為世界上老年人口最多的國(guó)家［2］。而應(yīng)用于臨床的AchE抑制劑大多存在半衰期短、較嚴(yán)重的外周膽堿能系統(tǒng)副作用等缺點(diǎn)，不利于患者長(zhǎng)期服用［3］。所以從大自然中開發(fā)、尋找具有適宜患者長(zhǎng)期服用、毒副作用小、作用面廣等優(yōu)點(diǎn)的AchE抑制劑受到科學(xué)研究者們的廣泛關(guān)注。豆豉作為中國(guó)的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品在南方地區(qū)深受老百姓的喜愛，它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。制作及食用豆豉在我國(guó)已有上千年歷史。豆豉具有較好的生理功能，已見報(bào)道的有預(yù)防糖尿病、抗氧化、降血壓、溶血栓、抗老年癡呆等作用［4］。本文探討了豆豉中AchE抑制劑的提取以及大孔樹脂對(duì)其富集工藝研究，為開發(fā)新型、適宜患者長(zhǎng)期服用、毒副作用小的治療老年癡呆癥的藥物打下基礎(chǔ)。

2010-03-09 *通訊聯(lián)系人

宋慶(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)。

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(08CR1418900)。