張春紅，張 瑩，趙 菲

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161)

利用固定化酶改善酸法大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的研究

張春紅，張 瑩，趙 菲

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161)

利用固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)對酸法大豆?jié)饪s蛋白(SPC)進(jìn)行改性，并對改性SPC進(jìn)行紅外光譜分析。通過單因素和正交實驗研究了MTG改性對SPC持水性和吸油性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固定化MTG添加量1U/g，pH 6.0，50℃下反應(yīng)2h時，改性后大豆?jié)饪s蛋白的持水性和吸油性分別比對照提高了24.8%和64.5%;與大豆分離蛋白相比，其凝膠性和吸油性分別高出58.3%和27.0%，持水性則低8.0%。

酸法大豆?jié)饪s蛋白，固定化MTG，改性，持水性，吸油性，紅外光譜

眾所周知，大豆?jié)饪s蛋白和分離蛋白因其功能性良好被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，兩者在實際應(yīng)用中既有相同點，又有許多不同點。相比較而言，大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量高，功能性好，但價格偏高;大豆?jié)饪s蛋白的凝膠性優(yōu)于分離蛋白，其持水性和吸油性稍差，但具有價格低的優(yōu)勢。MTG是一種蛋白質(zhì)聚合酶，能夠催化蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。本文以酸法大豆?jié)饪s蛋白為原料，以提高濃縮蛋白的持水性和吸油性為目的，采用固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶進(jìn)行改性，為擴(kuò)大大豆?jié)饪s蛋白的應(yīng)用范圍，提供一定的理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗［1-2］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆?jié)饪s蛋白、大豆分離蛋白 山東新嘉華集團(tuán);谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 江蘇一鳴精細(xì)化工有限公司;殼聚糖 上海伯奧生物技術(shù)科技有限公司;牛血清蛋白 生化試劑;其他試劑 均為分析純。

RVA-3D型快速粘度分析儀 澳大利亞Newport公司;傅立葉紅外光譜儀 Thermo Nicolet Corporation，USA;PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;UV2265紫外可見分光光度計 日本島津;SH Y22A水浴恒溫振搖器 江蘇丹陽門科教儀器廠; TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化MTG的制備 殼聚糖→殼聚糖溶液+凝結(jié)劑→殼聚糖微球→戊二醛交聯(lián)反應(yīng)→清洗抽濾→載體→加酶反應(yīng)→4℃過夜保存→抽濾清洗→固定化酶［3］

1.2.2 MTG酶活力的測定 采用比色法［4］。

1.2.3 固定化MTG添加量對酸法大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響 配制底物濃度為10%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0，分別加入1、5、10、15、20U/g的固定化MTG，50℃水浴2h。

1.2.4 固定化MTG作用溫度對酸法大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響 配制底物濃度為10%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0，加入5U/g的固定化MTG，分別于40、45、50、55、60℃反應(yīng)2h。

1.2.5 固定化MTG作用pH對酸法大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響作用 配制底物濃度為10%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，加入5U/g的固定化MTG，50℃反應(yīng)2h。

1.2.6 固定化MTG作用時間對酸法大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響作用 配制底物濃度為10%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH為6.0，加入5U/g的固定化MTG，50℃分別反應(yīng)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。

1.2.7 固定化MTG改性酸法大豆?jié)饪s蛋白的正交實驗設(shè)計 正交實驗設(shè)計因素水平見表1。

1.2.8 蛋白質(zhì)功能性的測定 蛋白質(zhì)含量的測定:采用GB/T5009.5-2003;溶解性的測定:采用雙縮脲比色法;凝膠性的測定:采用RVA-3D快速粘度分析儀;持水性和吸油性的測定:將1g樣品放入蒸餾水或豆油中攪拌，2000r/min離心30min，測量上清液的體積。持水性和吸油性分別用1g樣品所持水和油的克數(shù)表示;乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定:將1.5g樣品，分散于30mL水中，加入30mL豆油，勻漿機(jī)中均質(zhì)1min后于2000r/min離心5min。上述乳化液置于80℃水浴中加熱30min后，自來水中冷卻至室溫，再于2000r/min離心5min。乳化性為乳化層高度與液體總高度之比，乳化穩(wěn)定性為30min后乳化層高度與原始乳化層高度之比;起泡性和泡沫穩(wěn)定性:將2g樣品，懸浮于100mL水中，在勻漿機(jī)中均質(zhì)2min，停止均質(zhì)后立即量出泡沫總體積。將此樣品靜置30min后，量出下層析出液的體積。起泡性為均質(zhì)停止時泡沫體積與原溶液體積之比，泡沫穩(wěn)定性為靜置30min后泡沫體積與均質(zhì)停止時泡沫體積之比［5］。

1.2.9 FTIR分析 樣品和KBr以1∶50的比例混合，掃描次數(shù)16，分辨率4。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化MTG的操作穩(wěn)定性

用pH6.0的緩沖液浸泡固定化MTG，在50℃放置2h(模擬與底物反應(yīng))，重復(fù)測定固定化酶的酶活。從圖1可以看出，固定化酶連續(xù)反應(yīng)10次，酶活仍維持在75%以上。

圖1 固定化MTG的操作穩(wěn)定性

2.2 固定化MTG添加量對大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響

由圖2可知，隨固定化MTG添加量的增大，持水性和吸油性呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)加酶量為5U/g時，持水性和吸油性達(dá)到最大。分析原因可能是由于有限的底物濃度決定了有限的酰氨基和氨基的共價交聯(lián)反應(yīng)。因此，適宜的固定化MTG添加量為5U/g。

圖2 加酶量對SPC持水性和吸油性的影響

2.3 固定化MTG作用溫度對大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響

由圖3可知，隨溫度的升高，持水性和吸油性呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)作用溫度為50℃時，持水性和吸油性均達(dá)到最大。因此，適宜的反應(yīng)溫度為50℃。

圖3 溫度對SPC持水性和吸油性的影響

2.4 固定化MTG作用pH對大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響

由圖4可知，隨pH的增大，持水性和吸油性呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)作用pH為6.0時，持水性和吸油性均達(dá)到最大。分析原因可能是由于pH影響固定化MTG的空間構(gòu)象、所帶電荷量及活性基因的解離狀態(tài)，從而影響固定化MTG的活力和蛋白質(zhì)的功能性。因此，適宜的pH為6.0。

圖4 pH對SPC持水性和吸油性的影響

2.5 固定化MTG作用時間對大豆?jié)饪s蛋白持水性和吸油性的影響

由圖5可知，隨時間的延長，持水性和吸油性均呈增大的趨勢，但2h后，持水性和吸油性的變化均不明顯。因此，確定適宜的MTG反應(yīng)時間為2h。

2.6 固定化MTG改性酸法大豆?jié)饪s蛋白的正交實驗

由表1可以看出，影響持水性的主次順序為:反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH＞固定化MTG添加量＞反應(yīng)時間，最佳處理組合為A2B2C2D1。影響吸油性的主次順序為:反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH＞反應(yīng)時間＞固定化MTG添加量，最佳處理組合為A1B2C2D2。綜合考慮各因素對功能性的影響大小和經(jīng)濟(jì)效益，最終確定最佳處理組合為A1B2C2D2，即固定化MTG添加量1U/g，反應(yīng)pH 6.0，50℃條件下反應(yīng)2h。

圖5 時間對SPC持水性和吸油性的影響

表1 固定化MTG改性酸法大豆?jié)饪s蛋白的正交實驗結(jié)果

2.7 FTIR分析

從圖6和圖7中可看出，改性前SPC的特征吸收峰為:3289.26cm-1出現(xiàn)吸收峰是“酰胺 A吸收帶”，即N-H的伸縮振動;1659.73cm-1出現(xiàn)“酰胺Ⅰ吸收帶”，即C=O的伸縮振動;1532.33cm-1是“酰胺Ⅱ吸收帶”，即C-N伸縮振動或N-H的彎曲振動; 1239.01cm-1為“酰胺Ⅳ吸收帶”，即C-N伸縮振動或C-O的伸縮振動。經(jīng)固定化MTG改性的大豆?jié)饪s蛋白的酰胺的幾個特征吸收帶發(fā)生了變化: 3289.26cm-1和1532.33cm-1處的吸收向高波數(shù)位移，1659.73cm-1處的吸收向低波數(shù)位移，1239.01cm-1處吸收峰消失［6］。表明MTG只是對某些特殊氨基酸殘基起作用，形成共價交聯(lián)，對大多數(shù)氨基酸殘基沒有影響。同時驗證了MTG通過改變大豆?jié)饪s蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，改變了大豆?jié)饪s蛋白的功能性。

2.8 蛋白質(zhì)功能性的比較

經(jīng)MTG改性的大豆?jié)饪s蛋白與未改性的大豆?jié)饪s蛋白(對照)和分離蛋白功能性的比較見表2。

圖6 改性前大豆?jié)饪s蛋白FTIR譜圖

圖7 MTG改性后大豆?jié)饪s蛋白FTIR譜圖

表2 MTG改性大豆?jié)饪s蛋白與未改性的大豆?jié)饪s蛋白和分離蛋白功能性的比較

從表2中可知，經(jīng)MTG改性后，大豆?jié)饪s蛋白的持水性和吸油性分別比對照提高了24.8%和64.5%;與大豆分離蛋白相比，凝膠性和吸油性分別高出58.3%和27.0%，持水性則降低8.0%。

3 結(jié)論

3.1 MTG改性酸法大豆?jié)饪s蛋白的最佳條件為:固定化MTG添加量1U/g，pH 6.0，50℃下反應(yīng)2h，此時大豆?jié)饪s蛋白的持水性和吸油性分別為4.83g/g和2.73g/g，比對照提高了24.8%和64.5%。

3.2 與大豆分離蛋白相比，改性后酸法大豆?jié)饪s蛋白的凝膠性和吸油性分別高出58.3%和27.0%，持水性則低8.0%。

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Study on promoting the water holding and oil absorption capacity of acid leached soy protein concentrate by immobilized transglutaminase

ZHANG Chun-hong，ZHANG Ying，ZHAO Fei
(College of Food，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110161，China)

In this paper，acid leached soy protein concentrate(SPC)was modified by immobilized transglutaminase (MTG)，and infrared spectrum was used to analyze SPC.The influence of MTG on water holding and oil absorption capacity was researched by single factor and orthogonal experiment.The results showed that when the addition of immobilized MTG was 1U/g，pH was 6.0，temperature was 50℃，time was 2h，the water holding and oil absorption capacity were 24.8%and 64.5%higher than unmodified SPC gel.The property and oil absorption capacity were increased 58.3%and 27.0%，water holding capacity decreased 8.0%compared with soy protein isolate.

acid leached soy protein concentrate;immobilized MTG;modification;water holding capacity;oil absorption capacity;infrared spectroscopy

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)03-0208-04

2010-04-08

張春紅(1968-)，女，博士，副教授，主要從事植物蛋白質(zhì)、酶工程方面的研究。