徐 斐，農(nóng)衛(wèi)良，管 驍，秦旭銳，石服鑫

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

響應(yīng)面法優(yōu)化微量熱法檢測用菌體培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)研究

徐 斐，農(nóng)衛(wèi)良，管 驍，秦旭銳，石服鑫

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

利用微量熱法對(duì)醬牛肉中的細(xì)菌進(jìn)行快速定量檢測，需要對(duì)檢測用菌體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化從而實(shí)現(xiàn)其快速增殖，以期縮短檢測時(shí)間，同時(shí)放大細(xì)菌生長熱信號(hào)。本文采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了培養(yǎng)基配方的主要因素后，再用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步確定了各因素的最優(yōu)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖、pH、胰蛋白胨三個(gè)因素是影響醬牛肉中優(yōu)勢細(xì)菌生長的主要因素;優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1.42g/L、胰蛋白胨8.45g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈉5g/L、酵母浸膏4.5g/L、pH 7.12。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)醬牛肉中的細(xì)菌，可實(shí)現(xiàn)其快速增殖，并顯著縮短生長延滯期。

微量熱法，響應(yīng)面分析，培養(yǎng)基優(yōu)化，延滯期

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

受試菌種 均分離于市售醬牛肉中，由本實(shí)驗(yàn)室鑒定、計(jì)數(shù)。

UV-2800型可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;超凈工作臺(tái)、全自動(dòng)滅菌鍋、搖床等上海博訊有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將活化好的各菌種按實(shí)際樣品中的平均比例混勻后，取5mL菌懸液接種于裝有150mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于搖床(100r/min)中37℃培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 顯著影響因子的確定 根據(jù)菌種的大致營養(yǎng)需求，以7種對(duì)菌體生長可能造成較大影響的培養(yǎng)基成分以及pH作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的8個(gè)影響因素，以培養(yǎng)5h后的細(xì)菌生物密度(即發(fā)酵液在650nm處的吸光度，反映菌體生長情況)為響應(yīng)值進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)共32次，因子選擇及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中各因素的水平

1.2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 由于響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接領(lǐng)域里才充分近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無意義。所以，要先逼近各因素最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。可以通過做單因素實(shí)驗(yàn)或由菌種的特性和發(fā)酵工藝來確定因素水平的范圍。最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速地逼近最佳值區(qū)域［6］。

1.2.2.3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定出的最佳值區(qū)域，采用旋轉(zhuǎn)中心點(diǎn)正交實(shí)驗(yàn)法，配制不同的培養(yǎng)基。然后將細(xì)菌接種后37℃培養(yǎng)5h，測量其生物密度值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立均由SAS9.0輔助完成。

1.2.3 培養(yǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn) 將按比例混合好的菌懸液分別接種到普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行水浴搖床培養(yǎng)(37℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/min)不同時(shí)間(分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5h)后，分別測定兩種培養(yǎng)液OD650值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選顯著影響因子

本部分實(shí)驗(yàn)采用八因子兩水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇7種培養(yǎng)基成分作為優(yōu)化對(duì)象改變濃度，其它因素保持一致。測量培養(yǎng)液在5h后的650nm處吸光度，結(jié)果如表2所示。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 各因素的主要效應(yīng)分析表

由表3可以看出，8個(gè)因素中對(duì)響應(yīng)值影響顯著性依次為胰蛋白胨＞pH＞葡萄糖＞氯化鈉＞硫酸鎂＞酵母浸膏＞牛肉浸膏＞磷酸氫二鉀。其中胰蛋白胨、pH以及葡萄糖對(duì)細(xì)菌生長的影響最為顯著，其Pr＞F均小于0.05。因此響應(yīng)面分析過程中確定胰蛋白胨、pH和葡萄糖三個(gè)因素為主要影響因素。其中，胰蛋白胨的濃度和pH對(duì)OD值的影響是負(fù)效應(yīng)，葡萄糖的濃度對(duì)OD值的影響是正效應(yīng)。且由于磷酸氫二鉀及牛肉浸膏對(duì)細(xì)菌生長的影響極小，因此在后面所配的培養(yǎng)基中不再添加。而硫酸鎂、氯化鈉、酵母浸膏則選擇較優(yōu)水平，分別添加0.2、5、4.5g/L。

2.2 主要因素水平的確定(最陡爬坡實(shí)驗(yàn))

由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在優(yōu)勢菌液體培養(yǎng)過程中，葡萄糖、胰蛋白胨、pH這3個(gè)因素對(duì)細(xì)菌生長有重要的影響，根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)各因素進(jìn)行顯著性分析后結(jié)果如表3所示。

由表4可以看出，隨著實(shí)驗(yàn)號(hào)的增加響應(yīng)值先升高后降低。其中2號(hào)的響應(yīng)值最大，而1號(hào)的響應(yīng)值為0.748，大于3號(hào)實(shí)驗(yàn)的0.699。由此可以推斷出最佳培養(yǎng)基應(yīng)介于1號(hào)和2號(hào)之間。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)以及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的實(shí)驗(yàn)因素及水平確定3個(gè)因素的水平值，其實(shí)際值如表5所示。

表5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表

根據(jù)旋轉(zhuǎn)中心點(diǎn)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)23個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中8個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為析因點(diǎn)，零點(diǎn)重復(fù)9次［9-10］。具體設(shè)計(jì)如表6所示。

表6 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以細(xì)菌接種培養(yǎng)5h后在650nm處的吸光度為響應(yīng)值，采用SAS9.0軟件對(duì)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方程擬合回歸分析，結(jié)果如方程式(1)和表7、表8所示。

表7 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

表8 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方差分析表

由表7的結(jié)果可知，方程式(1)的R2值為0.81，可見方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的擬合關(guān)系良好［11-12］。同時(shí)，由表8可看出，方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響十分顯著，交叉項(xiàng)作用反而不是很明顯。根據(jù)上述回歸方程作出響應(yīng)面立體分析圖(見圖1～圖3)，可更直觀地反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響情況。

圖1 葡萄糖與胰蛋白胨對(duì)菌體生長的影響

圖2 胰蛋白胨與pH對(duì)菌體生長的影響

圖3 葡萄糖與pH對(duì)菌體生長的影響

圖1～圖3直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，葡萄糖、胰蛋白胨、pH對(duì)響應(yīng)值的影響都極為顯著，曲面較陡。從圖1可以看出，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度不變時(shí)，隨著胰蛋白胨的質(zhì)量濃度增大，響應(yīng)值先是逐漸增大，達(dá)到最大值之后，逐漸減小;胰蛋白胨質(zhì)量濃度不變時(shí)，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增大，響應(yīng)值的變化也是先增大后減小。同樣從圖2、圖3可見，隨著pH、葡萄糖和胰蛋白胨質(zhì)量濃度的變化，響應(yīng)值的變化趨勢也是先增后減，呈典型的二次函數(shù)變化趨勢。

對(duì)方程式(1)進(jìn)行偏導(dǎo)求零，得出該模型響應(yīng)值存在極值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)各因素的取值分別為:X1為0.42164、X2為0.55212、X3為-0.57218，對(duì)應(yīng)的實(shí)際值分別為:葡萄糖1.42g/L;胰蛋白胨8.45g/L;pH7.12時(shí)，響應(yīng)值Y即生物密度最大達(dá)0.943，微生物生長最好。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上的培養(yǎng)基優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行5次搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，測得響應(yīng)值分別為0.940、0.952、0.938、0.959、0.949，平均值為0.947，與回歸方程所得的估測值(0.943)差異不顯著，說明采用RSA法優(yōu)化得到的實(shí)驗(yàn)參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.5 與普通營養(yǎng)肉湯的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

圖4列出了混合優(yōu)勢菌在優(yōu)化培養(yǎng)基及普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的生長情況。從圖中可以看出，混菌在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長速度要遠(yuǎn)大于普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)270min后，普通培養(yǎng)基的OD650為0.561，而優(yōu)化培養(yǎng)基的OD650值達(dá)1.061，是普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的1.9倍。而且優(yōu)化培養(yǎng)基OD值曲線的斜率也明顯大于普通培養(yǎng)基。由此表明，細(xì)菌在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長延滯期更短，且生長速度更快、代時(shí)短，更有利于短時(shí)間內(nèi)混合菌的大量繁殖，有利于后續(xù)的細(xì)菌微量熱實(shí)驗(yàn)。

圖4 菌種在兩種培養(yǎng)基中的生長狀況

3 結(jié)論

本文對(duì)醬牛肉中的污染菌進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化研究，以促進(jìn)其快速增殖，從而達(dá)到放大細(xì)菌生長熱效應(yīng)以及縮短放熱時(shí)間的目的，以利于微量熱法對(duì)其進(jìn)行定量研究。通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了葡萄糖、pH、胰蛋白胨三因素是影響醬牛肉中優(yōu)勢菌生長的主要因素;經(jīng)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化出培養(yǎng)基配方為:葡萄糖含量為1.42g/L、胰蛋白胨含量為8.45g/L、pH為7.12、硫酸鎂含量為0.2g/L、氯化鈉含量為5g/L、酵母浸膏含量為4.5g/L。用此優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)醬牛肉中的細(xì)菌，可促進(jìn)其快速生長，并縮短其生長延滯期，有利于下一步的細(xì)菌微量熱的定量實(shí)驗(yàn)研究。

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Optimization of culture medium for rapid detection of bacterial in food using microcalorimetric method by response surface analysis

XU Fei，NONG Wei-liang，GUAN Xiao，QIN Xu-rui，SHI Fu-xin
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

During the rapid detection of bacterial in beef using the microcalorimetry method，the optimization of cultural medium is important because it is useful for the reduction of detection time and the enlargement of bacterial growth heat.In this paper，the Plackett-Burman design was used to evaluate the most important factors which affected the bacterial growth firstly.Furthermore，the steepest ascent and Box-Behnken design were used to approach the optimal level of the medium composition.The results showed that the concentration of glucose，tryptone and pH played most important roles in influencing the growth of the dominant bacteria in beef.The optimal cultural medium was determined as follows:glucose 1.42g/L，tryptone 8.45g/L，MgSO40.2g/L，NaCl 5g/L，yeast extract 4.5g/L，pH 7.12.It was possible that the bacterial in beef grew rapidly under the condition of the optimal cultural medium，and the lag phase of the bacterial was shortened greatly.

microcalorimetry;response surface analysis;optimization of cultural medium;lag phase

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0188-05

在影響我國食品安全的諸因素中，微生物污染問題高居首位，開發(fā)快捷準(zhǔn)確的微生物檢測方法尤有必要。國內(nèi)外近年來開發(fā)了一些微生物快速定量檢測技術(shù)［1-2］，包括:酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(ELISA)、DNA探針技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、ATP生物發(fā)光技術(shù)、直接表面熒光濾膜計(jì)數(shù)技術(shù)(DEFT)、比濁法、阻抗法等。然而這些方法或多或少都存在自身不可克服的局限性，如儀器復(fù)雜昂貴、檢測成本高、特異性過強(qiáng)、前處理復(fù)雜，造成應(yīng)用范圍有較大局限性。隨著微量熱技術(shù)的發(fā)展，利用該技術(shù)進(jìn)行微生物的定量研究已成為可能［3-4］。微量熱法主要優(yōu)勢在于檢測速度快、操作簡單、適用范圍廣，其原理為利用微生物生長產(chǎn)生的熱效應(yīng)。實(shí)際上微生物生長熱過程緩慢且熱效應(yīng)小，實(shí)現(xiàn)其準(zhǔn)確測定對(duì)設(shè)備要求很高。因此，若能縮短微生物生長放熱過程，且放大熱信號(hào)，則可對(duì)速測產(chǎn)生重要意義。微生物自身具有一定的營養(yǎng)需求和生長特性，完全可通過改變其生長環(huán)境的辦法來改善生長狀況，因此可對(duì)量熱用培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使微生物能在較短時(shí)間內(nèi)放出更多的熱，以便于快速檢測［2］。微生物的生長代謝受制于培養(yǎng)基的組分如碳源、氮源、生長因子、無機(jī)鹽等多種因子的影響。培養(yǎng)基的成分對(duì)微生物發(fā)酵液含菌量有很大的影響［5］。在多因子起作用的生化過程中，如何快速找出主要因子并進(jìn)行優(yōu)化并不是一件易事。響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并采用回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法［6-7］。本研究根據(jù)微生物的營養(yǎng)需要特性［8］，采用響應(yīng)面分析法對(duì)醬牛肉中優(yōu)勢菌的量熱培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究，以期獲得顯著縮短細(xì)菌生長延滯期的培養(yǎng)基配方，為量熱法快速檢測微生物研究提供新的思路和方法。

2010-01-12

徐斐(1972-)，女，博士，教授，主要從事食品安全快速檢測方面的研究。

上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目(08ZZ77);上海市研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(JWCXSL0902);上海高校選撥培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項(xiàng)基金(slg-07047)。