宋彥顯，閔玉濤，劉 江，馬慶一，*

(1.中州大學，河南鄭州450044; 2.鄭州輕工業(yè)學院，河南鄭州450002)

大黃中α-淀粉酶抑制因子的研究

宋彥顯1，閔玉濤1，劉 江2，馬慶一2，*

(1.中州大學，河南鄭州450044; 2.鄭州輕工業(yè)學院，河南鄭州450002)

采用甲醇粗提、石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、乙醇索氏極性梯度提取、pH梯度萃取以及硅膠制備板純化并結合各組分α-淀粉酶抑制活性跟蹤方法對大黃中α-淀粉酶抑制因子的分布進行了系統(tǒng)研究。結果表明，乙酸乙酯和乙醇組分對α-淀粉酶的抑制率分別為35.0%和26.9%;前者的pH梯度萃取組分為NaHCO3、Na2CO3、NaOH、剩余乙酸乙酯，對α-淀粉酶的抑制率依次為:66.5%、46.7%、58.1%和49.0%。其中NaHCO3組分用硅膠制備板純化并水解，經(jīng)薄層分析認定其苷元是大黃酸。純化后對α-淀粉酶的抑制率不升反降的事實暗示了粗樣中雜質的協(xié)同作用。

大黃，α-淀粉酶，抑制因子，糖尿病

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大黃 鄭州中藥城;豬胰α-淀粉酶 自制;試劑 均為國產(chǎn)分析純。

80-1離心機，721分光光度計，HH-S11-2電熱恒溫水浴鍋，RE52CS旋轉蒸發(fā)器，IOTA-1電熱鼓風干燥箱，新飛BCD-245D冰箱，GL21高速冷凍離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 相關試劑的配制和材料制備

1.2.1.1 明膠試劑 10g氯化鈉，1g明膠，加水定容至100mL。

表1 測定加樣表

1.2.1.2 三氯化鐵試劑 5%三氯化鐵的水溶液或醇溶液。

1.2.1.3 溴甲酚綠試劑 0.1%溴甲酚綠乙醇液。

1.2.1.4 顯色劑的配制 精確稱取1.66g鄰苯二甲酸、0.93g苯胺，將其溶于100mL水飽和的正丁醇中。

1.2.1.5 展開劑 正丁醇∶冰醋酸∶水(3∶1∶1)。

1.2.1.6 0.7%的CMC溶液的配制 稱取羧甲基纖維素0.7g，量取蒸餾水100mL，先加入5mL蒸餾水潤濕泡開的羧甲基纖維素，再緩緩加水，邊加水邊用牛角勺攪拌以防止溶液中出現(xiàn)大的懸浮顆粒，若溶液中還存在顆粒，應適當加熱溶化，無CMC顆粒時，加入剩余的蒸餾水混勻備用。

1.2.1.7 DNS試劑的配制 酒石酸鉀鈉18.2g，溶于50mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.03g、NaOH 2.1g、苯酚0.5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100mL，貯于棕色瓶中，室溫保存。

1.2.1.8 薄層分析板的制備和活化 稱取7g薄層層析用硅膠于研缽中，量取22mL配制好的CMC溶液加入其中，慢慢碾磨使兩者充分混合，并防止混入氣泡，將8塊小玻片(2.5cm×7.5cm)并排放置，將混合均勻的硅膠傾于小玻璃片上，用玻璃棒將其反復推鋪均勻(玻璃棒比小玻璃片高出2mm左右)，拿起小玻璃片在手上顛至均勻后，放平，令其自然陰干。將晾干的板置于烘箱中，緩慢升溫至115℃，活化1h后取出，放于玻璃干燥器皿中自然冷卻即可。

1.2.2 大黃中α-淀粉酶抑制因子的提取 稱取烘干粉碎至40目的大黃粉200g，甲醇回流提取(固液比1∶5)三次，抽濾后合并提取液，濃縮至浸膏狀，加入硅藻土，攪拌均勻后用濾紙包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、乙醇索氏提取48h。

1.2.3 大黃中α-淀粉酶抑制因子的定性實驗［2］

1.2.3.1 堿液實驗、醋酸鎂實驗和硼酸實驗 堿液實驗:加入10%NaOH，若呈現(xiàn)紅色，加H2O2，紅色不褪，加酸，紅色褪去為陽性;醋酸鎂實驗:加入1% MgAc2出現(xiàn)紅色為陽性;硼酸實驗:將乙醇提取液點在濾紙片上，噴灑1%硼酸水溶液，如呈現(xiàn)黃橙、紅色或熒光，表明含蒽醌及甙類。

1.2.3.2 α-萘酚實驗(Molisch紫環(huán)反應) 取檢品的水溶液1mL，加入5%萘酚乙醇溶液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入5～6滴濃硫酸，使之成兩液層，待2～3min后，兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)者為陽性(糖、多糖或甙類)。

1.2.3.3 三氯化鐵實驗與明膠實驗 三氯化鐵實驗:取檢品的水溶液1mL，加三氯化鐵試液1～2滴，呈現(xiàn)綠色、污綠色、藍黑色或暗紫色者為陽性(可水解鞣質顯藍—藍黑色，縮合鞣質顯綠色—污綠色)。明膠實驗:取檢品的水溶液1mL，加氯化鈉明膠溶液2～3滴，生成白色沉淀物則記作陽性。

1.2.3.4 鹽酸-鎂粉實驗 取檢品的乙醇溶液1mL，加放少量鎂粉，然后加濃鹽酸4～5滴，置沸水浴中加熱2～3min，呈現(xiàn)紅色者為陽性(游離黃酮類或黃酮甙)。

1.2.3.5 溴甲酚綠實驗 在干燥的濾紙上滴一滴待檢液體，待干燥后噴灑溴甲酚綠指示劑，在藍色的背景上顯黃色記為陽性(有機酸)。如果展開劑中含有乙酸，在噴灑顯色劑之前應于120℃烘烤除去。

1.2.4 梯度提取物對α-淀粉酶抑制活性跟蹤 用二甲基亞砜溶解甲醇粗提物、石油醚提取物，用水溶解剩余各梯度提取物，使其濃度為1mg/mL，共得到6個樣品溶液。臨用前取α-淀粉酶(146U/mg)稀釋2500倍。參照程秀麗［3］的方法并加以改進，實驗組分為空白管、對照管、樣品管和顏色干擾管，各管加樣如表1所示。

提取物對α-淀粉酶抑制率的計算:

其中:A1-空白;A2-對照;A3-加抑制劑;A4-顏色對照(甲醇粗提和石油醚提取物的抑制率計算中，A2采用二甲基亞砜對照組的值，其他采用對照組吸光度值)。

1.2.5 排除提取液活性測定中顯色干擾的方法

1.2.5.1 薄層層析法 酶解淀粉液點在薄層板上，因蒽醌極性較弱，會走到硅膠板的最頂端，將蒽醌與生成的糖分開，挖掉酶解淀粉生成的糖最后停留的位置處的硅膠，經(jīng)過碾磨，用蒸餾水浸提1h，再加DNS顯色定容，540nm下測吸光度值即可去除顯色干擾。

1.2.5.2 活性炭脫色法 將少量的活性炭置于1mL經(jīng)抑制劑作用但還未顯色的酶解淀粉體系(酶已滅活)混合5min，用熱的95%乙醇洗脫活性炭上吸附的糖，8000r/min離心5min后取上清液，定容后DNS顯色，540nm下測吸光度值。

1.2.5.3 有機溶劑萃取法 針對大黃甲醇粗提物或乙醚組分(用二甲基亞砜溶解)。取兩只試管，編號1、2。在1號管中加入0.6mL的酶反應體系液(酶已滅活)，在2號管中加入0.6mL的總反應體系液，各滴加1滴稀鹽酸，使體系呈弱酸性，再加入2mL的無水乙醚(或乙酸乙酯)，充分振蕩，靜置，大黃粗提液中對DNS顯色有干擾作用的弱酸性成分進入上層酯層，棄上酯層。再按上述萃取操作兩次，直至酯層幾乎不顯顏色，加0.2mL 5%NaOH后加DNS顯色。

表4 各提取組分的吸光度值

1.2.5.4 破壞蒽醌法(H2O2氧化法) 將20μL H2O2加入0.2mL反應體系中(于坩堝內(nèi))，充分振蕩反應1min用氧化法破壞蒽醌，然后將此坩堝在沸水浴中蒸干。調(diào)零，空白對照亦如此操作，以減少誤差。用蒸餾水少量多次地將坩堝中的干物質轉移到比色管中，加0.2mL DNS，顯色，定容至10mL，在540nm下測吸光度值。

1.2.6 乙酸乙酯組分的分離

1.2.6.1 乙酸乙酯組分的pH梯度萃取 將梯度提取得到的乙酸乙酯溶液濃縮、定容，以等體積 5% NaHCO3溶液萃取兩次，酯層待用，合并水相，用鹽酸酸化至pH為3.0，水相用NaCl飽和，用乙酸乙酯反萃取，棄水層。上層的有機相記作NaHCO3組分。NaHCO3溶液萃取過的酯層再以等體積5%Na2CO3溶液萃取兩次，酯層待用，合并水相，鹽酸酸化，用乙酸乙酯反萃取，棄去水層。上層所得記作Na2CO3組分。Na2CO3溶液萃取過的酯層再以等體積 1% NaOH分兩次振蕩萃取，合并水層萃取液，酯層記作乙酸乙酯組分。水層萃取液加鹽酸至酸性，用乙酸乙酯反萃，棄去水層。上層所得記作NaOH組分。分別做制備層析，展開劑為乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶25∶15)。

1.2.6.2 乙酸乙酯NaHCO3組分的純化及蒽醌苷的雙相酸水解 用乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶25∶15)為展開劑對NaHCO3組分做制備層析，進一步純化。純化后得到的組分經(jīng)雙相水解后，取少量該組分濃縮油狀物，置于50mL圓底燒瓶，加入10mL二氯甲烷和10mL 20%硫酸，在40℃恒溫水浴中攪拌反應30min。用分液漏斗分出二氯甲烷組分，加一小勺無水硫酸鈉干燥20min，濾去硫酸鈉固體，取濾液在薄層硅膠分析板上點樣。以石油醚∶乙酸乙酯(7∶3)為展開劑，觀察顏色斑點，并與乙醚組分的結果對照。

2 結果與討論

2.1 梯度提取

2.1.1 梯度提取得率 見表2。

表2 大黃各梯度組分的得率

2.1.2 定性實驗 由表3可知，石油醚提取液中主要含有機酸，乙醚提取液主要含有蒽醌苷元，而乙酸乙酯、乙醇提取液中主要含有蒽醌苷。

表3 大黃各梯度成分定性實驗結果

2.1.3 提取液對α-淀粉酶的抑制效果 按1.2.4的方法測定，結果如表4。

因大黃中的主要成分蒽醌與顯色劑DNS中的堿反應顯紅色或紫紅色，嚴重干擾還原糖與DNS的顯色。故按1.2.4方法不可行，因此要著力解決蒽醌干擾顯色的問題。

2.2 排除顯色干擾方法的選擇

薄層層析法因硅膠板規(guī)格不一，導致淀粉水解產(chǎn)物的最終位置有差異，在還未顯色之前“盲刮”，需碾磨、浸提和過濾等反復轉移，使得結果不能成理想的酶反應線性關系?；钚蕴棵撋m能脫除蒽醌的顏色，但吸附大量的糖，不易洗干凈，造成的誤差極大。有機溶劑萃取法只能除去提取液中一部分顏色干擾。H2O2破壞蒽醌法易產(chǎn)生H2O2殘留，會氧化3，5-二硝基水楊酸，影響顯色。實驗中采用了三種方法除去H2O2:沸水浴加熱法、真空濃縮法和沸水浴加熱坩堝中蒸干法。沸水浴加熱法難以除去H2O2，真空濃縮法操作繁瑣，沸水浴加熱坩堝中蒸干法效果較好，故均采用此法。

2.3 乙醇提取液對α-淀粉酶的抑制作用的酶反應動力學實驗

從圖1可以看出，以15min時的吸光度計算抑制率，乙醇組分的抑制率26.9%。

圖1 乙醇組分對淀粉酶的抑制活性

2.4 乙酸乙酯組分的進一步分離及所得各組分對α-淀粉酶的抑制效果

由圖2可知，前15min內(nèi)吸光度與時間成線性關系，以15min時的吸光度計算各成分的抑制率，結果顯示各成分的抑制率分別為:原乙酸乙酯組分35.0%，NaHCO3組分66.5%，Na2CO3組分 46.7%，NaOH組分58.1%，剩余組分49.0%，其中NaHCO3組分抑制率明顯高于其它組分。

圖2 乙酸乙酯pH梯度萃取各組分對α-淀粉酶的抑制活性

2.5 乙酸乙酯NaHCO3萃取組分的純化

由2.4可知，NaHCO3組分抑制率最高，因此采用用乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶25∶15)為展開劑進行制備層析，對其進一步純化。經(jīng)純化得到1個主要組分記為1#，考察1#對 α-淀粉酶的抑制效果，結果如圖3。

圖3 1#對淀粉酶的抑制活性

以30min的吸光度計算抑制率，結果其抑制率為22.2%。

將1#雙相水解(20%硫酸酸化和二氯甲烷1∶1)，得到苷元，將其與乙醚組分同板進行薄層層析(石油醚∶乙酸乙酯，7∶3)，并根據(jù)文獻報道的Rf值，可知得到的苷元是大黃酸。因此，可以確定大黃酸為苷元的蒽醌苷是α-淀粉酶的抑制因子。

3 結論

3.1 大黃經(jīng)甲醇粗提，石油醚，二氯甲烷，乙醚，乙酸乙酯，乙醇索氏梯度提取得到五個組分。化學和生物活性跟蹤實驗結果顯示，石油醚提取液中主要含有機酸，乙醚提取液主要含有蒽醌苷元，而乙酸乙酯、乙醇提取液中主要含有蒽醌苷。

3.2 探討了四種解決蒽醌色素干擾DNS顯色的途徑:a.薄層層析分離;b.活性炭脫色;c.有機溶劑萃取; d.H2O2氧化。結果發(fā)現(xiàn)，H2O2氧化法(沸水浴坩堝蒸干清除過量H2O2)去除蒽醌干擾效果較好。

3.3 以H2O2氧化法除蒽醌色素干擾DNS顯色的方法考察乙酸乙酯和乙醇組分對α-淀粉酶抑制作用，結果均表現(xiàn)出一定的抑制作用，其抑制率分別為35.0%和26.9%。

3.4 乙酸乙酯組分經(jīng)pH梯度萃取進一步分離、純化，檢測發(fā)現(xiàn)，四個組分NaHCO3、Na2CO3、NaOH和剩余乙酸乙酯均對 α-淀粉酶有抑制活性，其中以NaHCO3組分活性最高，它們的抑制率依次為: 66.5%、46.7%、58.1% 和 49.0%。對乙酸乙酯NaHCO3組分用硅膠制備板法純化，得到1#，其對α-淀粉酶的抑制率為22.2%。NaHCO3組分純化后對α-淀粉酶的抑制率反而降低，暗示了粗樣中雜質的協(xié)同作用。用水解法經(jīng)薄層分析得知，1#的苷元是大黃酸。

［1］高小平，張蔚瑜，鄒文俊，等.中藥提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(6): 536-538.

［2］北京醫(yī)學院.中草藥成分化學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1980:19.

［3］程秀麗.α-淀粉酶抑制劑的活性測定［J］.藥劑探討，2004，3(4):71-72.

Study on inhibitors of α-amylase in rhubarb

SONG Yan-xian1，MIN Yu-tao1，LIU Jiang2，MA Qing-yi2，*
(1.Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China; 2.Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

α-amylase inhibitory factors in rhubarb were studied systematically by the method of a combination of extraction with methanol，Soxhlet＆pH gradient extraction，purification by using preparative silica gel plates，and α -amylase inhibitory activity monitoring of the various components.The results showed that ethyl acetate and ethanol components of the α-amylase inhibition rates were 35.0%and 26.9%，respectively.α-amylase inhibitory rates of the pH gradient components of ethyl acetate，NaHCO3，Na2CO3，NaOH，and the remaining ethyl acetate were:66.5%，46.7%，58.1%and 49.0%respectively.The NaHCO3fraction was purified by using preparative silica gel plates，then hydrolyzed and analyzed with thin layer silica gel.The result indicated that its aglycone was rhein. The fact of a reducing inhibitory rate after purification implied that impurities in crude samples may have synergetic effect with the major ingredient.

rhubarb;α-amylase;inhibitory factor;diabetes

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)03-0184-04

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的，以高血糖為主要標志的臨床綜合癥。近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。根據(jù)糖尿病對胰島素的依賴與否，可分為Ⅰ型(胰島素依賴型)和Ⅱ型(非胰島素依賴型)，患者中約90%左右為Ⅱ型，其主要癥狀為餐后高血糖，由其引起的并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的重要原因之一。在消化過程中，淀粉等碳水化合物首先在α-淀粉酶催化作用下轉化為糊精和麥芽糖。后者進一步水解為葡萄糖，經(jīng)小腸吸收進入血液，餐后2h內(nèi)Ⅱ型糖尿病人的胰高血糖素比健康人高100%，使血糖積累，導致餐后高血糖。α-淀粉酶抑制劑可抑制酶的活性，從而推遲淀粉水解產(chǎn)生單糖的時間，達到降低血糖峰值、平抑血糖濃度的目的。因而α-淀粉酶抑制因子的研究是防治糖尿病以及肥胖癥的重要研究領域之一。大黃長期在中國傳統(tǒng)經(jīng)典醫(yī)學中被認為是一種有降糖作用的中草藥，其水提液具有α-淀粉酶抑制活性的事實已見報道［1］，但其作用機制以及活性組分的詳情尚不清楚。本課題則以大黃的分離純化并結合α-淀粉酶抑制活性跟蹤為手段進一步披露了其活性的細節(jié)，從而為其繼續(xù)研究與開發(fā)增加了感性材料。

2009-12-21 *通訊聯(lián)系人

宋彥顯(1979-)，女，碩士研究生，助教，主要從事天然產(chǎn)物提取及功能性食品研究。