孫麗平，莊永亮，汪東風(fēng)

(1.昆明理工大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院食品工程研究中心，云南昆明650224; 2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003)

賴氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對銅離子的螯合作用

孫麗平1，莊永亮1，汪東風(fēng)2

(1.昆明理工大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院食品工程研究中心，云南昆明650224; 2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003)

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)具有抗氧化活性，特別是金屬螯合作用。本文制備了一定條件下的賴氨酸-葡萄糖MRPs，采用零交一階導(dǎo)數(shù)分光光度法研究了MRPs對銅離子的螯合作用，分析了螯合銅離子對MRPs抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，螯合銅離子使MRPs中具有紫外光吸收的小分子物質(zhì)發(fā)生電子重排，不影響大分子黑素類物質(zhì)的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu);一些銅螯合位點(diǎn)對MRPs的還原能力和自由基清除能力有貢獻(xiàn)。

美拉德反應(yīng)，抗氧化，金屬螯合，一階導(dǎo)數(shù)分光光度法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-葡萄糖(D-Glucose，Glu)、L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine，Lys)、紫尿酸胺(tetramethylmurexide，TMM) 生化試劑;甲醇 色譜級;DPPH· 購自Sigma公司;其他 均為分析純;整個(gè)實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

UV-2102PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯;螺口密封玻璃管(16×160mm) 德國Schott; DKU-3恒溫油槽 上海精宏;Delta 320 pH計(jì) 美國梅特勒-托利多。

1.2 Lys-Glu體系MRPs的制備

取0.015mol的Lys和Glu溶于50mL超純水中，用1mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.68。分裝溶液(5mL)至螺口玻璃管中，充氮?dú)?min，密封，120℃油浴加熱8h，六個(gè)平行，加熱結(jié)束，冰水浴迅速冷卻。4℃存放至測試。

表1 MRPs的抗氧化活性及不同濃度的銅離子對其抗氧化能力的影響

MRPs溶液隨加熱時(shí)間延長由無色、淺黃色、黃色、橘色、棕色至褐色，澄清透明。原液濃度計(jì)為反應(yīng)物總濃度，即100.8mg/mL，測試時(shí)適度稀釋。

1.3 MRPs紫外-可見吸收光譜分析

將MRPs原液用超純水100倍稀釋(1∶100，v/v)，以未加熱樣品為對照，測定溶液198～552nm的吸收光譜。測定參數(shù):1cm雙面石英比色杯，1nm掃描精度，1.8nm光譜通帶寬度，掃描六次。分析樣品在紫外和可見區(qū)的特征吸收峰，記錄最大吸收峰波長(λmax)，分析美拉德產(chǎn)物的產(chǎn)生情況。

1.4 MRPs抗氧化活性分析

測定MRPs的還原能力-還原Fe3+→Fe2+的能力［2］、自由基清除能力-DPPH自由基清除活性［2］和銅離子螯合能力-紫尿酸胺雙波長分光光度法［3］。

1.5 零交一階導(dǎo)數(shù)分光光度法分析MRPs對銅離子的螯合作用

取20倍稀釋(1∶20，v/v)的MRPs溶液0.5mL于5mL離心管，加入1.5mL Hex緩沖液和0.5mL溶于緩沖液的硫酸銅溶液(0～5mmol/L)，混勻，室溫下放置1h。以同樣處理的未加熱樣品為對照，測定溶液198～552nm的紫外-可見吸收光譜并轉(zhuǎn)換成一階導(dǎo)數(shù)圖譜。

1.6 不同濃度的銅離子對 MRPs抗氧化活性的影響

取用1.5中螯合銅離子后的MRPs溶液，按照1.4方法測定不同銅離子濃度對MRPs抗氧化能力的影響，無銅MRPs的抗氧化能力為對照。

2 結(jié)果與討論

美拉德反應(yīng)是連續(xù)的多途徑并行的瀑布式化學(xué)過程，通常被分為三個(gè)階段:初級階段、高級階段和終級階段［4］。初級階段開始于羰基和氨基縮合、環(huán)化、脫水等，產(chǎn)生Amadori/Henys化合物;高級階段Amadori/Henys化合物降解，釋放氨基化合物，羰基化合物降解為鄰?fù)穷愇镔|(zhì);鄰?fù)穷愇镔|(zhì)裂解和Strecker降解反應(yīng)［5］產(chǎn)生大量的活性小分子物質(zhì);小分子物質(zhì)自身或相互間聚合，進(jìn)入終級階段，產(chǎn)生顏色大分子黑素類物質(zhì)。

2.1 MRPs紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見吸收光譜分析(圖1中譜帶1)表明，MRPs在近紫外區(qū)220、294nm和可見光360nm處有特征吸收峰。

美拉德反應(yīng)高級階段產(chǎn)生的大量活性小分子物質(zhì)，如酮類和醛類衍生物等［4］，在近紫外區(qū)有強(qiáng)吸收。這些小分子物質(zhì)組成極其復(fù)雜，不能一一鑒定分析［6-9］。294nm吸收峰在各種美拉德反應(yīng)體系中都有報(bào)道［2，6-9］。但220nm吸收峰鮮有報(bào)道，可能是已有研究直接測定MRPs特定波長(294、360、420nm等)下的吸光值，較少進(jìn)行光譜掃描。小分子有機(jī)酸產(chǎn)物，如甲酸、乙酸等在此波長下有特征吸收，一些酰胺類物質(zhì)也有吸收;鄰?fù)穷愇镔|(zhì)［5］可能也對220nm吸收峰有貢獻(xiàn)。反應(yīng)高級階段后，小分子產(chǎn)物聚合到大分子碳骨架上，成為大分子產(chǎn)物的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)，在可見光區(qū)360nm產(chǎn)生吸收峰。

圖1 不同銅離子濃度環(huán)境中MRPs紫外-可見吸收光譜組合圖注:1:0mmol/L;2:1mmol/L;3:2mmol/L;4:5mmol/L。

2.2 MRPs的抗氧化活性

本實(shí)驗(yàn)條件下的MRPs具有一定的還原能力、自由基清除能力和金屬螯合能力(表1)。美拉德反應(yīng)中氨基還原酮類產(chǎn)物具有較強(qiáng)的還原能力［4］;反應(yīng)高級階段產(chǎn)物能夠提供氫原子［10］表現(xiàn)還原能力;從美拉德反應(yīng)機(jī)制角度講［11］，中性條件下主要為電子傳遞機(jī)制，使體系表現(xiàn)還原能力。具有供氫和供電子能力的美拉德高級階段產(chǎn)物能夠使DPPH·發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而消除;同時(shí)MRPs混合物中的自由基產(chǎn)物也能夠直接與DPPH·結(jié)合為穩(wěn)定物質(zhì)。MRPs的金屬螯合能力被認(rèn)為是終級階段大分子黑素類物質(zhì)的作用［12］，具體機(jī)理不清楚。氨基酸［13］和初級階段的西夫堿類［14］是有效的金屬螯合劑，所以反應(yīng)體系中的未反應(yīng)的氨基酸和產(chǎn)生的西夫堿等對銅離子應(yīng)具有螯合作用，這個(gè)問題在美拉德反應(yīng)研究中未見討論。

2.3 零交一階導(dǎo)數(shù)分光光度法分析MRPs對銅離子的螯合作用

本實(shí)驗(yàn)條件下的MRPs在不同銅離子濃度環(huán)境中的紫外-可見光吸收圖譜組合如圖1所示。隨銅離子濃度增加，220nm最大吸收峰逐漸消失;294nm有輕微的減色效應(yīng)，大分子黑素類物質(zhì)的360nm特征峰幾乎沒有變化，表明銅離子與MRPs發(fā)生了作用，使MRPs中的一些小分子物質(zhì)發(fā)生電子重排［1］。這說明具有供氫和供電子活性的小分子物質(zhì)具有螯合銅離子的作用，螯合銅離子后自身發(fā)生電子重排，全部或部分損失對光吸收的能力。但銅離子螯合后不影響大分子產(chǎn)物的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)。

MRPs是極其復(fù)雜的混合物，一階導(dǎo)數(shù)圖譜較零階圖譜更有效地分析銅離子螯合作用。如圖2所示，與零階圖譜的三個(gè)特征峰相對應(yīng)，MRPs的一階導(dǎo)數(shù)圖譜具有三個(gè)較規(guī)則的振幅(圖2A)，分別是D210～230、D270～300和 D340～390，表明本實(shí)驗(yàn)條件下 MRPs混合物是由三類結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)組成的，而每類物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上較為類似，這可能是體系只有一種糖和氨基酸，產(chǎn)物組成相對比較簡單。與零階圖譜變化規(guī)律類似，在不同銅離子濃度環(huán)境中，MRPs的一階導(dǎo)數(shù)圖譜隨銅離子濃度增加而不斷變化，主要是振幅D210～230消失(圖2B～圖2D)。零交一階導(dǎo)數(shù)圖譜分析表明，初始pH為中性，120℃加熱8h的Glu-Lys產(chǎn)物中的小分子物質(zhì)對金屬螯合有一定的作用，大分子黑素類產(chǎn)物的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)不易被金屬離子影響。

圖2 不同銅離子濃度環(huán)境中MRPs紫外-可見吸收光譜一階導(dǎo)數(shù)圖譜注:A:0mmol/L;B:1mmol/L;C:2mmol/L;D:5mmol/L。

2.4 不同銅離子濃度對MRPs抗氧化能力的影響

在不同銅離子濃度環(huán)境中MRPs的還原能力和DPPH·清除能力明顯降低，但是下降趨勢不同，還原能力一直下降至對照樣品的55%左右，而DPPH·清除能力先下降至對照的66%左右，然后隨銅濃度的增加上升至對照的73%左右，這個(gè)現(xiàn)象在美拉德反應(yīng)研究中未見報(bào)道。上述零交一階導(dǎo)數(shù)圖譜分析表明MRPs螯合銅離子后，一些活性小分子物質(zhì)發(fā)生電荷重排，可能失去供氫和供電子能力，使還原力和自由基清除能力損失，說明一些銅螯合位點(diǎn)對這兩方面的抗氧化作用是有貢獻(xiàn)的。

3 結(jié)論

初始pH6.68，120℃加熱8h后的Lys-Glu美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在還原能力、自由基清除能力和金屬螯合三個(gè)方面都有效果;零交一階導(dǎo)數(shù)圖譜分析表明，MRPs中的小分子物質(zhì)對螯合銅離子有一定的作用，螯合銅離子后自身發(fā)生電子重排;大分子黑素類產(chǎn)物的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)不受銅離子影響;螯合銅離子后MRPs還原能力和自由基清除能力下降，說明一些銅離子螯合位點(diǎn)對MRPs的還原能力和自由基清除能力有貢獻(xiàn)。

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Study on Cu2+-chelating function of Maillard reaction products from lysine-glucose model system

SUN Li-ping1，ZHUANG Yong-liang1，WANG Dong-feng2
(1.Research Center of Food Engineering，College of Chemistry and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224，China;2.The Laboratory of Food Science，College of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

The antioxidant activity of MRPs from lysine-glucose model system was investigated，especially its Cu2+-chelating function by zero-crossing first-derivative spectrophotometry was studied.The results showed that Cu2+-chelating to MRPs made the electronic rearrangement in low molecular weight intermediates，and partly destroyed the reducing power and DPPH-scavenging ability.The results indicated that the antioxidant properties of MRPs were a result of multiple mechanisms，and Cu2+-binding sites had reducing power or DPPH·scavenging ability.

Maillard reaction;antioxidant activity;metal-chelating effect;first derivative spectrophotometry

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0169-03

MRPs被認(rèn)為是具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物，能夠延緩脂質(zhì)氧化、抑制多酚的酶促褐變等。美拉德反應(yīng)過程非常復(fù)雜，MRPs是混合物，產(chǎn)物組成和性質(zhì)因反應(yīng)條件而有較大的差異，抗氧化效果是混合物的綜合表現(xiàn)。目前對于MRPs的抗氧化機(jī)理報(bào)道較少，而MRPs對金屬離子具有螯合作用被認(rèn)為是其抗氧化機(jī)理之一［1］。賴氨酸對美拉德反應(yīng)最為敏感，葡萄糖是食品加工和生物體中最常見的還原糖，賴氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物普遍存在，研究其抗氧化效果和金屬螯合作用是很有意義的。為此，本文制備了一定條件下的賴氨酸-葡萄糖MRPs，測定了其抗氧化效果，利用零交一階導(dǎo)數(shù)分光光度法研究了MRPs對銅離子的螯合作用，分析了不同銅離子濃度對抗氧化效果的影響，以期為MRPs的抗氧化機(jī)理及對微量金屬元素吸收利用的影響等研究提供資料。

2010-02-25

孫麗平(1981-)，女，博士，講師，研究方向:食品安全與營養(yǎng)。