于 博，張煥新，金征宇，*，徐學明，謝正軍

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122; 2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院食品科技系，江蘇泰州225300)

環(huán)糊精及其衍生物對普魯蘭酶抑制機理的研究

于 博1，張煥新2，金征宇1，*，徐學明1，謝正軍1

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122; 2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院食品科技系，江蘇泰州225300)

通過研究不同條件下環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的差異，探討其對普魯蘭酶抑制的機理。結果表明，疏水性空腔對芳香族氨基酸的包合作用是環(huán)糊精與普魯蘭酶相互作用的內在因素，空腔大小、側鏈基團、濃度、pH與溫度都明顯地影響了環(huán)糊精與普魯蘭酶的相互作用。同時考察了不同環(huán)糊精濃度下的普魯蘭酶內源性熒光光譜，分析了環(huán)糊精對普魯蘭酶結構與微環(huán)境的影響。

環(huán)糊精，普魯蘭酶，疏水性空腔，芳香族氨基酸殘基，熒光光譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-環(huán)糊精(α-CD)、β-環(huán)糊精(β-CD)、γ-環(huán)糊精(γ-CD)、葡萄糖基-β-環(huán)糊精(G1-β-CD)和麥芽糖基-β-環(huán)糊精(G2-β-CD)sigma公司;普魯蘭酶 無錫杰能科生物有限公司;其他試劑 國產分析純。

V-1800分光光度計 上海美普達公司;AB135-S型電子分析天平、Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司;F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 普魯蘭酶活性的測定 在0.5mL，1%的普魯蘭溶液中加入0.5mL適當稀釋的普魯蘭酶溶液，反應體系為pH的乙酸緩沖液，50℃反應30min，采用DNS法測定還原糖的生產量，一個酶活力單位定義為每分鐘分解普魯蘭多糖生成相當于1μmol葡萄糖的酶量。相對剩余酶活力(RRA)定義為添加環(huán)糊精及其衍生物時的酶活力與空白酶活力之比。普魯蘭酶使用前經過實驗室進一步純化。

1.2.2 熒光光譜測定 普魯蘭酶的熒光光譜用Hitachi F-7000熒光光譜儀測定，激發(fā)波長選擇295nm，發(fā)射波長為200～400nm，激發(fā)和發(fā)射波長狹縫寬度設定為5nm，掃描速度為12000nm/min，室溫下測定熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 環(huán)糊精種類對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

由圖1可知，在普魯蘭酶水解體系中加入各種環(huán)糊精后，普魯蘭酶的水解活性都受到了明顯的抑制。β-環(huán)糊精及其衍生物對普魯蘭酶的活性抑制明顯強于α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，由于環(huán)糊精與酶的相互作用與環(huán)糊精特有疏水性空腔有關，因此環(huán)糊精的空腔與普魯蘭酶分子是否匹配決定了其對酶活性的影響能力。三種常見的環(huán)糊精α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的疏水性空腔直徑分別為0.47～0.53nm、0.6～0.65nm和0.75～0.83nm，其空腔外部圓周直徑以及空腔高度也各不相同，這些因素都影響到了環(huán)糊精分子與酶分子相互作用。由圖1可知，α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精加入后，普魯蘭酶的活性分別下降了約10%、90%和20%。這表明，β-環(huán)糊精分子具有更容易進入酶分子空間的幾何尺寸，其疏水性空腔更加適合與酶分子的芳香族氨基酸發(fā)生包合作用。當β-環(huán)糊精接枝上分支糖基后，其對普魯蘭酶的抑制能力發(fā)生了明顯的變化。由圖1可知，β-環(huán)糊精、葡萄糖基-β-環(huán)糊精和麥芽糖基-β-環(huán)糊精精加入后，普魯蘭酶的活性分別下降了約90%、70%和50%。隨著分支側鏈的延長，環(huán)糊精抑制酶活性的能力遞減。這主要是因為分支側鏈通過α-1，6糖苷鍵接枝到母體β-環(huán)糊精后，增加了環(huán)糊精疏水性空腔與普魯蘭酶作用位點的空間位阻，而且分支鏈長的增加不僅會增加空間位阻，更會影響到母體環(huán)糊精疏水性空腔固有的幾何尺寸與極性。根據實驗結果可知，β-環(huán)糊精對普魯蘭酶的抑制作用最強。為進一步了解環(huán)糊精與普魯蘭酶相互作用的影響因素，下面的實驗主要考察不同條件下β-環(huán)糊精對普魯蘭酶活性的影響。

圖1 環(huán)糊精種類對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.2 環(huán)糊精濃度對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

在普魯蘭酶的水解體系中，分別添加不同濃度的β-環(huán)糊精，考察普魯蘭酶活性與β-環(huán)糊精濃度間的相關性。由圖2可知，隨著β-環(huán)糊精濃度的增加，普魯蘭酶的活性呈下降的趨勢。在環(huán)糊精濃度達到1mmol/L后，普魯蘭酶的失活速率增加;當環(huán)糊精濃度達到10mmol/L時，普魯蘭酶的剩余酶活不足33%。這表明β-環(huán)糊精與普魯蘭酶的相互作用具有濃度依賴效應，低濃度時，β-環(huán)糊精與普魯蘭酶分子的相互作用并沒有引起酶分子的活性構象的變化;隨著β-環(huán)糊精濃度的增加，與普魯蘭酶分子相互作用的疏水性空腔增加，致使酶分子的活性構象發(fā)生扭曲，酶活性逐漸喪失。

圖2 環(huán)糊精濃度對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.3 pH對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

由圖3可知，pH對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響呈先增強后降低的趨勢，在pH4～6范圍內，環(huán)糊精對普魯蘭酶抑制作用最強，當pH為5時，普魯蘭酶的剩余酶活降至13%左右。pH的變化不僅會改變酶分子活性中心的必需基團的解離程度，而且會影響酶分子的構象變化。因此，pH4～6時的普魯蘭酶分子更適合與環(huán)糊精發(fā)生相互作用。這也說明，環(huán)糊精與普魯蘭酶的相互作用，不僅與環(huán)糊精自身的疏水性空腔有關，還與酶分子自身的性質有關。

圖3 pH對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.4 溫度對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

由圖4可知，溫度對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響呈先增強后降低的趨勢，當溫度達到60℃時，普魯蘭酶的剩余酶活降至約11%。溫度的變化同樣影響了酶自身的構象變化，因而影響了酶與環(huán)糊精疏水性空腔的相互作用。當溫度升高時，酶分子間的聚集比低溫下變得松散，有利于環(huán)糊精分子進入到酶分子中，從而與更多的疏水性氨基酸發(fā)生復合作用，導致酶活性構象的喪失。

圖4 溫度對環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.5 環(huán)糊精對普魯蘭酶微環(huán)境與結構的影響

大部分的酶分子中都含有芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，而這三類氨基酸因側鏈生色基團的不同而具有不同的熒光特性。其中色氨酸的熒光強度最大，酪氨酸次之，苯丙氨酸最小。在酶構象的研究中，常常根據芳香族氨基酸的熒光特性來推測酶分子的構象以及微環(huán)境變化。由于色氨酸殘基對微環(huán)境變化敏感，因此色氨酸殘基常作為酶分子的內源性熒光探針來研究不同條件下酶分子構象和微環(huán)境變化的信息。由圖5可知，在295nm激發(fā)波長下，普魯蘭酶的最大發(fā)射波長在340nm處。隨著β-環(huán)糊精濃度的不斷增加，熒光強度明顯增強。這主要是由于隨著環(huán)糊精的加入，疏水性空腔逐漸增加，其與普魯蘭酶分子的芳香族氨基酸殘基之間的包合作用不斷增加，一方面保護了熒光體的單重態(tài)，避免了溶液中如氧自由基的猝滅，并束縛分子自由度，增大其輻射速率;另一方面，環(huán)糊精的疏水性空腔提供一個更加非極性的微環(huán)境，增強了熒光量子效率。這也進一步證明了疏水性空腔與芳香族氨基酸殘基之間的包合作用是環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的內在驅動力。從圖5還可以看到，隨著環(huán)糊精濃度的增加，發(fā)射光譜發(fā)生了藍移，最大波長由340nm藍移至337nm，這表明環(huán)糊精的加入改變了普魯蘭酶分子的結構和微環(huán)境。酶分子致密的結構逐漸變得松散，先前埋藏在酶分子內部的一部分色氨酸殘基暴露在一個更加非極性的環(huán)糊精中，酶分子活性所處微環(huán)境的疏水性增加，活性構象發(fā)生改變，從而導致普魯蘭酶的活性降低。

圖5 環(huán)糊精對普魯蘭酶內源性熒光的影響

3 結論

本實驗通過考察不同條件下環(huán)糊精對普魯蘭酶活性的影響。研究發(fā)現，疏水性空腔是環(huán)糊精及其衍生物與普魯蘭酶相互作用的內在因素。疏水性空腔與普魯蘭酶的芳香族氨基酸殘基形成了復合物，改變了普魯蘭酶本身的活性構象，導致了普魯蘭酶的失活。環(huán)糊精疏水性空腔的幾何尺寸是環(huán)糊精與普魯蘭酶相互作用的重要影響因素，其決定了二者相互匹配的效率。體系的pH與溫度影響了普魯蘭酶與環(huán)糊精的相互作用，其主要是由于酶自身結構隨pH與溫度變化而變化，導致了環(huán)糊精與普魯蘭酶結合位點的改變。環(huán)糊精衍生物中，側鏈基團的引入增加了空間位阻，降低了環(huán)糊精疏水性空腔與普魯蘭酶的結合率。

［1］金征宇，徐學明，陳寒青，等.環(huán)糊精化學—制備與應用［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2009:1-3.

［2］HAMILTON L M，KELLY C T，FOGARTY W M.Review: cyclodextrins and their interaction with amylolytic enzymes［J］. Enzyme Microb Tech，2000，26(8):561-567.

［3］PINOTSIS N，LEONIDAS D D，CHRYSINA E D，et al.The binding of β-and γ-cyclodextrins to glycogen phosphorylase b: kinetic and crystallographic studies［J］.Protein Sci，2003，12(9): 1914-1924.

［4］HARPER J B，EASTON C J，LINCOLN S F.Cyclodextrins to increase the utility of enzymes in organic synthesis［J］.Curr Org Chem，2000，4(4):429-454.

［5］EASTON C J，HARPER J B，HEAD S J，et al.Cyclodextrins to limit substrate inhibition and alter substrate selectivity displayed by enzymes［J］.J Chem Soc Pakistan，2001，1(6):584-587.

［6］LóPEZ-NICOLáS J M，NU'NˇEZ-DELICADO E，PéREZLóPEZ A J，et al.Reaction’s mechanism of fresh apple juice enzymatic browning in the presence of maltosyl-β-cyclodextrin［J］.J Incl Phenom Macrocycl Chem，2007，57(1-4):219-222.

［7］LóPEZ-NICOLáS J M，PéREZ-LóPEZ A J，CARBONELL -BARRACHINA，et al.Kinetic study of the activation of banana juice enzymatic browning by the addition of maltosyl-βcyclodextrin［J］.J Agric Food Chem，2007，55(23):9655-9662.

［8］LóPEZ-NICOLáS J M，NU'NˇEZ-DELICADO E，SáNCHEZFERRER á，et al.Kinetic model of apple juice enzymatic browning in the presence of cyclodextrins:the use of maltosyl-βcyclodextrin as secondary antioxidant［J］.Food Chem，2007，101 (3):1164-1171.

［9］尤新.淀粉糖品生產與應用手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2010:21-22.

［10］王建一，林松毅，張旺，等.玉米葡萄糖全糖粉制備過程中的糖化及脫色技術研究［J］.食品科學，2008，29(10): 263-266.

［11］MARSHALL J J.Inhibition of pullulanase by Schardinger dextrins［J］.FEBS Lett，1973，37(2):269-273.

［12］IWAMOTO H，OHMORI M，OHNO M，et al.Interaction between pullulanase from Klebsiella pneumoniae and cyclodextrins［J］.J Biochem，1993，113(1):93-96.

［13］IWAMOTO H，OHMORI M，OHNO M，et al.Comparison of the binding of β-CD with pullulanase from Klebsiella pneumoniae as studied by equilibrium and kinetic fluorometry［J］.J Biochem，1994，116(6):1264-1268.

Insight into inhibition mechanism of cyclodextrin and its derivatives on pullulanase

YU Bo1，ZHANG Huan-xin2，JIN Zheng-yu1，*，XU Xue-ming1，XIE Zheng-jun1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Food Science Department，Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College，Taizhou 225300，China)

Effects of different cyclodextrins on the activity of pullulanase were investigated to explore the inhibition mechanism of cyclodextrin on pullulanase in this work.The results indicated that the interaction between β-CD and pullulanase molecules was due to the formation of inclusion complexes between hydrophobic cavities and aromatic amino acid residues of pullulanase and was influenced by geometric dimension of hydrophobic cavities，side chain groups of cyclodextrin，concentration，pH and temperature.Meanwhile，the effect of cyclodextrin on the structure and microenvironment of pullulanase was analyzed by the intrinsic fluorescence spectroscopy.

cyclodextrin;pullulanase;hydrophobic cavities;aromatic amino acid residues; fluorescence spectroscopy

TS201.2+3

A

1002-0306(2011)03-0109-04

環(huán)糊精(Cyclodextrins，CDs)是由環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)作用于淀粉而生成的一類環(huán)狀低聚糖，其具有一個環(huán)外親水、環(huán)內疏水且有一定尺寸的立體手性空腔結構，能與極性相似、分子大小匹配的不同類型客體分子形成主客體復合物［1］。在很多生物反應中，環(huán)糊精可以與底物或催化反應的酶分子基團形成復合物，從而影響反應速率或反應平衡［2-3］。在一些生物反應中，環(huán)糊精通過增溶反應底物或激活酶加快反應速率［4-5］;而在另一些反應中，環(huán)糊精會成為酶反應的抑制劑［6-8］。生物大分子復合物是近年來研究的熱點，隨著酶與有機小分子之間的相互作用的研究日益深入，環(huán)糊精作為酶反應的激活劑或抑制劑，其作用機制亟需進一步深入研究。普魯蘭酶(Pullulanase，E.C.3.2.1.41)是淀粉酶家族的一個重要成員，其在食品工業(yè)尤其是高葡萄糖漿、超高麥芽糖漿、啤酒發(fā)酵以及淀粉改性等領域應用廣泛。它能專一性水解α-1，6糖苷鍵，并可以將最小單位的支鏈分解，最大限度地利用具有分支的淀粉原料［9-10］。研究發(fā)現，在普魯蘭酶的水解體系中，β-環(huán)糊精的加入會使普魯蘭酶的活性大大降低［11］，而且動力學實驗證明β-環(huán)糊精是普魯蘭酶的競爭性抑制劑［12-13］。但是，環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的機制仍不清楚，其相互作用的影響因素也需要進一步的探索。因此，本實驗主要通過研究不同條件下環(huán)糊精對普魯蘭酶活性的影響規(guī)律，探討環(huán)糊精對普魯蘭酶抑制的機理。

2010-11-17 *通訊聯(lián)系人

于博(1981-)，男，博士，研究方向:碳水化合物。

國際科技合作計劃(2007DFA31120);江蘇省自然科學基金創(chuàng)新學者攀登項目(BK2008003)。