孫紅男，孫愛東，陳 健，高雪娟

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，北京100083)

體外化學(xué)模擬體系中蘋果多酚抗氧化及清除亞硝酸根離子活性的研究

孫紅男，孫愛東*，陳 健，高雪娟

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，北京100083)

通過測定蘋果多酚對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、亞硝酸根離子的清除作用，對脂質(zhì)過氧化和β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制作用，以及還原能力等實(shí)驗(yàn)，研究了蘋果多酚的體外抗氧化活性，并與VC進(jìn)行了對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘋果多酚對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、亞硝酸根離子均有不同程度的清除作用，對脂質(zhì)過氧化和β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系有一定的抑制作用，對Fe3+具有良好的還原能力。因此，蘋果多酚是一種良好的天然抗氧化及清除亞硝酸根離子的活性物質(zhì)。

蘋果渣，蘋果多酚，自由基，抗氧化活性，亞硝酸根

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果多酚粉末 本實(shí)驗(yàn)室采用超聲波輔助乙醇溶液從蘋果渣中提取，NKA-9大孔樹脂提純，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥后備用;二苯基苦味?；诫禄杂苫?DPPH·)Sigma公司;無水乙醇、鄰二氮菲、亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、抗壞血酸、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸等 均為分析純。

Spectrum紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;PHS-3D型精密型pH計(jì) 上海三信儀表廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果多酚對羥自由基的清除作用 采用水楊酸法［7］。在反應(yīng)體系中先加入5mmol/L的水楊酸-乙醇2mL、10mmol/L的FeSO41mL，混勻，分別加入一定體積1.0mg/mL的蘋果多酚溶液，使終體系中蘋果多酚具有不同的濃度，并用去離子水將反應(yīng)體系補(bǔ)至7mL，最后加 2mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃保溫30min，于510nm處測定吸光值。

按照式(1)計(jì)算，得到不同濃度下蘋果多酚對羥自由基的清除率。

其中:A0為空白對照液的吸光值，An為加入蘋果多酚后的吸光值，A'n為不加H2O2時(shí)蘋果多酚的本底吸光值。

1.2.2 蘋果多酚對超氧陰離子自由基的清除作用

采用鄰苯三酚法［7］。取pH8.2的Tris-HCl 3mL，分別加入一定體積1.0mg/mL的蘋果多酚溶液，使終體系中蘋果多酚具有不同的濃度，并用去離子水使反應(yīng)體系補(bǔ)至9mL，混勻，25℃水浴平衡20min。然后加入0.6mL 7mmol/L的鄰苯三酚，混勻，立即放入分光光度計(jì)中，測定325nm處的吸光值，記錄反應(yīng)5min后的結(jié)果(測各樣品時(shí)，以去離子水代替鄰苯三酚調(diào)節(jié)0點(diǎn))。

按照式(2)計(jì)算，得到不同蘋果多酚濃度下對超氧陰離子自由基的清除率。

其中:A0為空白對照液的吸光值，An為加入蘋果多酚后的吸光值。

1.2.3 蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用［7］取8支試管，分別加入一定體積的1.0mg/mL蘋果多酚溶液，使終體系中蘋果多酚具有不同的濃度，用去離子水補(bǔ)至3mL，每管中加入120μmol/L的DPPH乙醇溶液3mL，混勻，常溫避光靜置30min，517nm下測定吸光值。

按照式(3)，得到不同蘋果多酚濃度下對DPPH自由基的清除率。

其中:A0為空白對照液的吸光值，An為加入蘋果多酚后的吸光值。

1.2.4 蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用［8］脂質(zhì)體的制備:卵磷脂1g溶解于50mL磷酸鹽緩沖溶液中(0.2mol/L pH=7.4)，充入CO2封口，置于超聲波清洗機(jī)中混合均勻，4℃保存待用。

脂質(zhì)過氧化活性的檢測:于反應(yīng)體系中先后加入1mL脂質(zhì)體，0.1mL蘋果多酚溶液，0.5mL 0.05mol/L的FeSO4溶液，1.2mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L pH =7.4)，混勻，37℃水浴2h。加入1%的硫代巴比妥酸溶液1mL，10%的鹽酸溶液1mL，100℃水浴30min后冷卻，加入5mL氯仿，3000r/min離心20min，在532nm下測吸光值。

按照式(4)，得到不同蘋果多酚濃度對脂質(zhì)過氧化的抑制率。

其中:A0為空白對照液的吸光值，An為加入蘋果多酚后的吸光值。

1.2.5 蘋果多酚還原能力的測定［9］在2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的蘋果多酚溶液2.5mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合物在50℃恒溫20min后，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液5mL加蒸餾水5mL和0.1%FeCl3溶液1mL，在700nm處測定吸光值，吸光值越高，還原能力越強(qiáng)。

1.2.6 蘋果多酚對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制作用［10］反應(yīng)液的配制:將5mg的β-胡蘿卜素溶于10mL氯仿中，再加入0.25mL的亞油酸和2mL的Tween-20，將此混合液移入圓底燒瓶中于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4min，之后加入500mL蒸餾水。

向各試管中加入1mL不同濃度的蘋果多酚溶液和4mL反應(yīng)液，置于50℃水浴中每隔25min測其在470nm處的吸光值(分別在不同濃度蘋果多酚溶液構(gòu)成的體系中，以蒸餾水代替β-胡蘿卜素作為空白調(diào)零)，共測量150min。

按照式(5)，得到不同蘋果多酚濃度下對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制率。

其中:A0和 At分別為加入蘋果多酚后0和150min時(shí)的吸光值，A'0和A't分別為不加蘋果多酚時(shí)0和150min時(shí)的吸光度。

其中:A0為只加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，An為加入蘋果多酚后的吸光值，A'n為蘋果多酚溶液本底吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果多酚對羥自由基的清除作用

以VC作為對照，按照1.2.1的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚對羥自由基(·OH)的清除能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 蘋果多酚對羥自由基的清除作用

由圖1可知，蘋果多酚和VC對羥自由基均有清除效果。蘋果多酚溶液在較低濃度時(shí)就能產(chǎn)生清除羥自由基的效果，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度低于2.5mg/mL時(shí)，清除率隨濃度增加而增強(qiáng);濃度高于2.5mg/mL時(shí)，清除率呈下降趨勢;濃度為2.5mg/mL時(shí)，清除率最高，達(dá)到96.5%。VC清除率增幅較緩，濃度在1.3～3.0mg/mL時(shí)，蘋果多酚對羥自由基的清除率高于VC。

根據(jù)文獻(xiàn)［12］分析原因?yàn)?蘋果多酚結(jié)構(gòu)中含有供氫體，能夠提供氫質(zhì)子，使具有高度氧化性的自由基被還原，從而終止自由基的連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的效果。但在高濃度時(shí)，它將反應(yīng)Fe2++H2O2→Fe3++OH+·OH中的 Fe3+還原成Fe2+，反而促進(jìn)了羥自由基的產(chǎn)生。蘋果多酚及VC對羥自由基清除率的IC50分別為0.8、0.6mg/mL。

2.2 蘋果多酚對超氧陰離子自由基的清除作用

以VC作為對照，按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚對超氧陰離子自由基的清除能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 蘋果多酚對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖2可知，蘋果多酚和VC對超氧陰離子均有清除效果，且隨濃度增大清除率提高。蘋果多酚溶液濃度小于2.5mg/mL時(shí)，清除率隨濃度增大而提高趨勢顯著;濃度大于2.5mg/mL時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定;濃度為2.5mg/mL時(shí)，清除率最高，達(dá)到98.2%。VC清除率增幅較緩，相同濃度下，蘋果多酚的清除率明顯高于VC。蘋果多酚及VC對超氧陰離子自由基清除率的IC50分別為1.2、2.3mg/mL。

2.3 蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用

以VC作為對照，按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚對DPPH自由基的清除能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，蘋果多酚和VC對DPPH自由基均有清除效果，且隨濃度增大，清除率提高。蘋果多酚溶液濃度小于2.0mg/mL時(shí)，清除率隨濃度增大而提高;濃度大于2.0mg/mL時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定;濃度為2.0mg/mL時(shí)，清除率最高，達(dá)到95.9%。VC清除率增幅趨勢與蘋果多酚相近，相同濃度下，VC清除率略高于蘋果多酚。蘋果多酚及VC對DPPH自由基清除率的IC50分別為0.9、0.8mg/mL。

圖3 蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用

2.4 蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用

以VC作為對照，按照1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用

由圖4可知，蘋果多酚和VC對脂質(zhì)過氧化均有抑制效果，且隨濃度增大，抑制率提高。蘋果多酚溶液濃度小于3.0mg/mL時(shí)，抑制率隨濃度增大而提高;濃度大于3.0mg/mL時(shí)，抑制率趨于穩(wěn)定;濃度為3.0mg/mL時(shí)，抑制率最高，達(dá)到96.8%。VC抑制率增幅緩慢，相同濃度下，蘋果多酚抑制率明顯高于VC。蘋果多酚及VC對脂質(zhì)過氧化抑制率的IC50分別為1.4、2.9mg/mL。

2.5 蘋果多酚還原能力的測定

以VC作為對照，按照1.2.5的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚的還原能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 蘋果多酚的還原能力

由圖5可知，蘋果多酚與VC均有良好的還原能力，是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基形成惰性物質(zhì)，以中斷自氧化鏈鎖反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，蘋果多酚與VC的還原能力和濃度成正相關(guān)，相同濃度下，VC的還原能力高于蘋果多酚。

2.6 蘋果多酚對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制作用

以VC作為對照，按照1.2.6的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 蘋果多酚對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制作用

由圖6可知，蘋果多酚和VC對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系均有抑制效果，且隨濃度增大，抑制率提高。蘋果多酚溶液濃度小于3.0mg/mL時(shí)，抑制率隨濃度增大而提高;濃度大于3.0mg/mL時(shí)，抑制率趨于穩(wěn)定;濃度為3.0mg/mL時(shí)，抑制率最高，達(dá)到97.9%。VC抑制率增幅緩慢，相同濃度下，蘋果多酚抑制率明顯高于VC。蘋果多酚及VC對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系抑制率的 IC50分別為 1.0、2.5mg/mL。

圖7 蘋果多酚對亞硝酸根離子)的清除能力

以VC作為對照，按照1.2.7的實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果多酚對亞硝酸根離子()的清除能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。由圖7可知，蘋果多酚與VC對均有清除作用，并呈一定的量效關(guān)系。蘋果多酚溶液濃度低于1.0mg/mL時(shí)，對的清除效果較弱，隨著蘋果多酚溶液濃度增大，清除效果隨之提高。當(dāng)濃度為1.0～2.5mg/mL時(shí)，清除率增加很快;當(dāng)濃度大于2.5mg/mL，清除率增勢趨緩;濃度為4.5mg/mL時(shí)，蘋果多酚對NO2-的清除率最高，達(dá)到92.3%。VC清除率增幅不明顯，相同濃度下，蘋果多酚對亞硝酸根離子(NO2-)清除率明顯高于VC。蘋果多酚及VC對亞硝酸根離子(NO2-)清除率的IC50分別為1.8、2.9mg/mL。

3 討論

生物體內(nèi)氧的單電子還原，生物分子的酶促氧化和自氧化都可產(chǎn)生各種氧自由基，其中以羥基自由基作用最強(qiáng)，毒性最大。這些自由基的強(qiáng)反應(yīng)性是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷和衰老的主要原因［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蘋果渣多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化性能，在對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除作用，以及對脂質(zhì)過氧化、β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化的抑制作用方面，明顯優(yōu)于抗壞血酸;對DPPH自由基的清除作用與抗壞血酸相似;還原能力明顯低于抗壞血酸。這表明蘋果渣多酚類物質(zhì)與抗壞血酸具有不同的抗氧化作用機(jī)制。

亞硝胺是一種具有強(qiáng)烈致癌作用的化合物，它能引起人和動(dòng)物的肝臟等器官惡性慢性腫瘤。正常情況下，人們直接從食物中攝入的亞硝胺量是微乎其微的，但形成N-亞硝胺類的前體物質(zhì)卻大量存在于食物及其體內(nèi)代謝過程中［14］。亞硝酸根離子是一種能形成N-亞硝胺類的前體物質(zhì)，而蘋果渣多酚類物質(zhì)防癌活性表現(xiàn)的一個(gè)重要方面就是能清除亞硝酸根離子從而抑制亞硝化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蘋果渣多酚類物質(zhì)具有良好的清除亞硝酸根離子能力，在濃度4.5mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)92.3%，清除效果明顯高于抗壞血酸。

4 結(jié)論

通過以上研究可知，蘋果渣多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、亞硝酸根離子均有明顯的清除作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨蘋果多酚溶液濃度的增大而提高，清除率IC50值分別為0.8、1.2、0.9、1.8mg/mL。當(dāng)蘋果多酚濃度為2.5mg/mL時(shí)，對羥自由基的清除率可達(dá) 96.5%;當(dāng)蘋果多酚濃度為2.5mg/mL時(shí)，對超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)98.2%;當(dāng)蘋果多酚濃度為2.0mg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率可達(dá) 95.9%;當(dāng)蘋果多酚濃度為4.5mg/mL時(shí)，對亞硝酸根離子的清除率可達(dá)92.3%。蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化、β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化有很強(qiáng)的抑制作用，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抑制率隨蘋果多酚溶液濃度的增大而提高，抑制率IC50值分別為1.4、1.0mg/mL。當(dāng)蘋果多酚濃度為3.0mg/mL時(shí)，對脂質(zhì)過氧化的抑制率可達(dá)96.8%，對β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化的抑制率可達(dá)97.9%。此外，蘋果多酚具有良好的還原能力。相同濃度下，蘋果多酚對羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸根離子的清除作用，以及對脂質(zhì)過氧化、β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化的抑制作用明顯優(yōu)于抗壞血酸;對DPPH自由基的清除作用與抗壞血酸相似;還原能力明顯低于抗壞血酸。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)論為進(jìn)一步研究蘋果多酚的抗氧化及抗癌活性，并為蘋果多酚在抗氧化食品、藥品、化妝品方面的開發(fā)以及藥理學(xué)的研究提供了理論依據(jù)。

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Study on antioxidant activity and nitrite scavenging activity of apple polyphenols in vitro simulated chemical system

SUN Hong-nan，SUN Ai-dong*，CHEN Jian，GAO Xue-juan
(Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

The antioxidant effect of apple polyphenols from apple pomace was studied by evaluations of hydroxy radical scavenging activity，superoxide radical scavenging activity，DPPH radical scavenging activity，nitrite scavenging activity，lipid oxidation inhibiting activity，β-carotin/linolic acid oxidation inhibiting，and reducing power.Results showed that apple polyphenols had significant hydroxy radical scavenging activity，superoxide radical scavenging activity，DPPH radical scavenging activity and nitrite scavenging activity，and also significant in reducing power，lipid oxidation inhibiting activity and β-carotin/linolic acid oxidation inhibiting activity.It was indicated that apple polyphenols from apple pomace had high capacity of antioxidation and nitrite scavenging activity.

apple pomace;apple polyphenols;free radical;antioxidant activity;nitrite

TS255.1

A

1002-0306(2011)11-0079-05

蘋果多酚是蘋果中天然存在的一類重要生物活性物質(zhì)，其中包括:類黃酮類、單寧類、酚酸類及花色苷等。本課題組近幾年通過大量研究已發(fā)現(xiàn)，蘋果多酚具有多種生物活性，如抑菌、抑制酪氨酸酶活性、抗癌等?？寡趸芰εc人類健康有著密切聯(lián)系，當(dāng)人體抗氧化機(jī)能出現(xiàn)障礙時(shí)(如自由基產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化、抗氧化酶活力降低等)，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞損傷，積累到一定程度就會(huì)引起心臟病、癌癥、衰老等。此外，形成亞硝胺的前體物質(zhì)“亞硝酸根”大量存在于食物及體內(nèi)代謝過程中，亞硝胺是很強(qiáng)的致癌物質(zhì)，阻斷亞硝胺合成或消除亞硝胺的前體，是防治癌癥產(chǎn)生的有效途徑之一［1］。天然產(chǎn)物中的多酚類化合物，如黃酮、原花青素、有機(jī)酸等，不僅具有抗氧化作用，而且能夠阻斷亞硝胺合成或清除亞硝酸根［2-3］。Karamac'M［4］從蕎麥種子及皮渣中分離得到的單寧酸具有很強(qiáng)的抗氧化活性，Kiritsakis K等人［5］研究表明，橄欖葉中提取的多酚類物質(zhì)也有很好的抗氧化活性，Mariod A A等人［6］研究發(fā)現(xiàn)從一種蕨類植物(Monechma ciliatum)葉子中提取的多酚類物質(zhì)能夠提高玉米油的穩(wěn)定性。本文通過幾個(gè)體外化學(xué)模擬體系研究了蘋果渣中多酚類物質(zhì)的體外抗氧化活性以及對亞硝酸根的清除作用，以期為蘋果多酚作為天然抗氧化劑和功能性食品的開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2010-12-08 *通訊聯(lián)系人

孫紅男(1983-)，女，博士研究生，主要從事蘋果多酚提取及生物活性研究。

國家“十一五”支撐計(jì)劃課題(2006BAD05A13)。