金裕范，高雪巖，王文全，2*，練晶軍

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102）

云南普洱茶抗氧化活性的比較研究

金裕范1，高雪巖1，王文全1，2*，練晶軍1

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102）

目的：比較云南5個(gè)產(chǎn)地普洱茶的抗氧化活性。方法：選擇3年發(fā)酵的普洱餅茶，采用DPPH測(cè)定其抗氧化活性和自由基消除活性。結(jié)果：5個(gè)產(chǎn)地的普洱茶提取物均具有一定的抗氧化活性，以云南大理下關(guān)產(chǎn)普洱茶的抗氧化能力最強(qiáng)，其EC50值為8.88 mg·L－1，云南思茅最弱，其EC50值為21.81 mg·L－1，云南5個(gè)產(chǎn)地普洱茶抗氧化活性的強(qiáng)弱順序依次為：大理下關(guān)普洱茶＞西雙版納普洱茶＞臨滄普洱茶＞紅河普洱茶＞思茅普洱茶。結(jié)論：普洱茶是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑和自由基消除劑，云南不同產(chǎn)地普洱茶的抗氧化活性略有差異。

普洱茶；抗氧化活性；DPPH

普洱茶屬黑茶類，原產(chǎn)于我國云南西雙版納地區(qū)，是以云南特有的大葉茶Camellia sinensis（Linn.）var.assamica（Masters）Kitamura為原料，經(jīng)殺青、揉捻、日曬等工序制成曬青毛茶，再經(jīng)特殊后發(fā)酵工藝并經(jīng)蒸壓制成的各種規(guī)格的成品茶，因早期集散地在云南普洱縣而得名。普洱茶在渥堆發(fā)酵過程中，發(fā)生轉(zhuǎn)化、酶促及非酶促氧化、降解、縮合等化學(xué)反應(yīng)，形成了非常復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)，除含有多酚類、兒茶素類、黃烷雙醇、黃酮類、酚酸類、茶色素類和皂苷類等主要活性成分外，還含有多種生物堿、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和有機(jī)酸類化合物等成分。普洱茶具有降血脂[1]、減肥[2]、暖胃助消化[3]、抗癌[4]、健齒護(hù)牙[5]、降壓[6-7]、防治糖尿病[8-9]、提高免疫力、抗氧化[10]、生津止渴、醒酒解毒等多種功效[11]。大量研究表明，普洱茶的多種藥理活性均與其抗氧化活性相關(guān)。該論文以5份云南不同產(chǎn)地的3年生普洱茶（熟茶）為研究對(duì)象，比較了其粗提物的抗氧化活性差異，為綜合評(píng)價(jià)云南不同產(chǎn)地普洱茶的質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司），Unico UV-2100型分光光度計(jì)（尤尼克上海儀器有限公司）、AG-204型電子天平（Mettler Toledo Co.LTD）。

1.2 材料與試劑

普洱茶選用云南紅河、西雙版納、大理下關(guān)、思茅、臨滄生產(chǎn)的3年發(fā)酵餅茶，DPPH（1，1-二苯基-2-苦基苯肼，Sigma），抗壞血酸對(duì)照品（分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 普洱茶粗提物的制備

稱取50.0 g研碎樣品，室溫冷水超聲提取3次，每次30 min，減壓濃縮，得干燥樣品粉末，備用。

2.2 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

稱取7.5 mg抗壞血酸，置于250 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋成30 mg·L－1的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

避光稱取15.0 mg DPPH，置于500 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成30 mg·L－1的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，用移液管量取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于6個(gè)10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用。

2.4 抗壞血酸DPPH清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別將6個(gè)濃度的抗壞血酸溶液1.0mL與5.0mL DPPH溶液迅速混勻，反應(yīng)30 min。以空白溶劑（5.0 mL甲醇＋1.0 mL蒸餾水）為參比液，以樣品空白溶液（5.0 mL DPPH溶液＋1.0 mL蒸餾水）為對(duì)照，在517 nm處測(cè)定各溶液的吸光度A，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，取其平均值，并計(jì)算其清除率，清除率計(jì)算公式：清除率 E% ＝（AControl－ASample）/AControl×100，式中AControl為未加抗壞血酸溶液的DPPH溶液（5.0 mL DPPH溶液＋1.0 mL蒸餾水）的吸光度，ASample為 DPPH溶液與樣品溶液（5.0 mL DPPH溶液＋1.0 mL樣品溶液）反應(yīng)后的吸光度。

以抗壞血酸質(zhì)量濃度（mg·L－1）為橫坐標(biāo)，DPPH清除率（%）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程Y＝18.74X－0.821 9（r＝0.999 6），線性范圍為0.50～5.00 mg·L－1，根據(jù)回歸方程計(jì)算抗壞血酸的 EC50＝2.71 mg·L－1（EC50值為清除 50%DPPH自由基所需的樣品濃度）。

2.5 普洱茶抗氧化活性測(cè)定

稱取2.5 g普洱茶粗提物粉末，置于250 mL容量瓶中，加入蒸餾水使其溶解，定容至刻度，搖勻，得樣品溶液，分別在5.0 mL DPPH溶液中加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL樣品溶液，用蒸餾水補(bǔ)足6.0 mL，迅速混勻，反應(yīng)30 min。以空白溶劑（5.0 mL甲醇＋1.0 mL蒸餾水）為參比液，以樣品空白溶液（5.0 mL DPPH溶液＋1.0 mL蒸餾水）為對(duì)照，在517 nm處測(cè)定溶液的吸光度A，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，取平均值。以樣品質(zhì)量濃度（mg·L－1）為橫坐標(biāo)，DPPH清除率（%）為縱坐標(biāo)繪制樣品的清除率曲線，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)計(jì)算線性回歸方程，見圖1。

圖1 不同產(chǎn)地普洱茶DPPH清除率曲線

研究結(jié)果表明，5份普洱茶均對(duì)DPPH具有清除作用，DPPH的清除率與普洱茶的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的正相關(guān)線性關(guān)系。EC50，即DPPH清除率為50%時(shí)樣品的質(zhì)量濃度，是評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力和自由基清除能力的常用指標(biāo)。EC50值越小，樣品清除自由基能力越強(qiáng)，即抗氧化活性越強(qiáng)。根據(jù)5份普洱茶DPPH清除率的回歸方程，計(jì)算樣品的EC50值，見表1。

由表1可見，5份供試的普洱茶均具有一定的抗氧化活性，以云南大理下關(guān)產(chǎn)普洱茶的DPPH清除能力最強(qiáng)，其EC50＝8.88 mg·L－1；云南思茅產(chǎn)普洱茶的DPPH清除能力最弱，其EC50＝21.81 mg·L－1。5份云南普洱茶抗氧化活性的強(qiáng)弱順序?yàn)椋捍罄硐玛P(guān)普洱茶＞西雙版納普洱茶＞臨滄普洱茶＞紅河普洱茶＞思茅普洱茶。

表1 不同產(chǎn)地普洱茶DPPH清除率的線性方程及EC50值

3 討論

DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging capacity）方法最早由 Brand Williams等報(bào)道[12]。DPPH·是少數(shù)穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基之一，具有深紫色，在515 nm下具有最大吸收值。該方法的原理是測(cè)定對(duì)DPPH·的還原能力，通過計(jì)算DPPH·剩余一半時(shí)所需抗氧化劑的濃度（EC50）反映抗氧化物的活性。DPPH測(cè)定方法簡(jiǎn)便，易于操作，被廣泛用于抗氧化活性化合物的篩選。該論文選擇DPPH法比較了5個(gè)不同產(chǎn)地的3年發(fā)酵普洱熟茶的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的普洱茶抗氧化活性存在一定的差異。

普洱茶的化學(xué)成分非常復(fù)雜，多酚類、黃酮類、多糖類等化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。呂海鵬等[13]認(rèn)為醋酸乙酯萃取部位為抗氧化活性部位，從該部位分離鑒定出的化合物主要有兒茶素類化合物、黃酮類化合物（山柰酚、槲皮素和楊梅素）以及黃酮的糖苷等，均具有較多的羥基及較強(qiáng)的自由基清除能力。揭國良等[14]研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸是普洱茶中的主要抗氧化活性成分之一。

本課題組對(duì)云南5個(gè)產(chǎn)地普洱茶的化學(xué)成分的分析，發(fā)現(xiàn)沒食子酸含量的順序?yàn)椋捍罄硐玛P(guān)普洱茶（14.82‰）＞臨滄普洱茶（6.97‰）＞西雙版納普洱茶（5.39‰）＞紅河普洱茶（4.04‰）＞思茅普洱茶（3.08‰）。普洱茶中沒食子酸含量與其抗氧化活性的變化趨勢(shì)基本相同，說明沒食子酸可能對(duì)普洱茶抗氧化活性有較大貢獻(xiàn)，但普洱茶中還存在其他的未知抗氧化活性成分。

據(jù)研究報(bào)道[15]，氧化和絡(luò)合是抗氧化的兩個(gè)主要因素，這兩個(gè)要素發(fā)揮抗氧化作用的途徑歸納起來有四個(gè)方面：清除自由基、螯合金屬離子、清除氧、作用于與自由基有關(guān)的酶。普洱茶中抗氧化成分復(fù)雜，其具體的抗氧化作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，推測(cè)可能為一個(gè)多途徑、多通路的復(fù)合作用。

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Com paritive Research on the Antioxidant Activity of Pu’er Tea from Different Origins

JIN Yu-fan1，GAO Xue-yan1，WANGWen-quan1，2，LIAN Jing-jun1
（1．BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China；2．GoodAgricultural
PracticeEngineeringResearchCenterofEducationMinistry，Beijing100102，China）

Objective：To compare the antioxidant activity of Pu’er tea from five areas in Yunnan province，China.Methods：Antioxidant activity of three-year-fermentative Pu’er tea was determined by DPPH method.Results：Antioxidant activity was detected from five Pu’er tea extracts.The activity of Pu’er tea from Dalixiaguan was the strongest，EC50value was 8.88 mg·L－1；Pu’er tea from Simao was theweakest，EC50value was 21.81 mg·L－1.The antioxidant activities of five Pu’er teas were as following：Dalixiaguan＞Xishuangbanna＞Lincang＞Honghe＞Simao.Conclusion：Pu’er tea was a good natural antioxidant and clearing agent of free radical，and for the activity，differenceswere present among five Pu’er teas producing areas in Yunnan province，China.

Pu’er Tea；Antioxidant Activity；DPPH

*王文全，Tel：（010）84738334，E-mail：wwq57＠126.com

2011-02-19）